第17章核酸技术 Technology of Nucleic Acid
第17章 核酸技术 Technology of Nucleic Acid
本章主要内容: 旬DNA重组技术 旬基因鉴定 旬核酸技术的应用
本章主要内容： DNA重组技术 基因鉴定 核酸技术的应用
个梦想已成真 对遗传分子核酸的结构与功能的阐明,用于研究核酸的工具酶 的开发,由核酸的分子杂交性质建立起的一系列分析技术,使我 们已经能够按照自己的意愿来摆布和操作基因,去改变生命有机 体的遗传性状,甚至制造出新的物种,以服务于人类。重组DNA 技术使人类干百年的梦想变为了现实
对遗传分子核酸的结构与功能的阐明，用于研究核酸的工具酶 的开发，由核酸的分子杂交性质建立起的一系列分析技术，使我 们已经能够按照自己的意愿来摆布和操作基因，去改变生命有机 体的遗传性状，甚至制造出新的物种，以服务于人类。重组DNA 技术使人类千百年的梦想变为了现实。 一个梦想已成真
生长激素基因注入小鼠受精卵中培育出了“硕鼠”」
生长激素基因注入小鼠受精卵中培育出了“硕鼠
1DNA重组技术 DNA重组技术是利用多种限制性内切酶和DNA连接酶等工具酶,以 DNA为操作对象,在细胞外将—种外源DNA(来自原核或真核生物)和 载体DNA重新组合连接(重组),形成重组DNA,然后将重组DNA转 入宿主细胞(如大肠杄菌等),使外源基因DNA在宿主细胞中随宿主细 胞的繁殖而增殖,并在宿主细胞中得到表达,最终获得基因表达产物或 改变生物原有的传性状。“基因工程”( gene engIneering)或"分 子克隆”( molecular cloning)
1.DNA重组技术 DNA重组技术是利用多种限制性内切酶和DNA连接酶等工具酶，以 DNA为操作对象，在细胞外将一种外源DNA（来自原核或真核生物）和 载体DNA重新组合连接（重组），形成重组DNA，然后将重组DNA转 入宿主细胞（如大肠杆菌等），使外源基因DNA在宿主细胞中随宿主细 胞的繁殖而增殖，并在宿主细胞中得到表达，最终获得基因表达产物或 改变生物原有的遗传性状。“基因工程”（gene engineering）或“分 子克隆”（molecular cloning）
Gene Gene Restriction DNA molecule Fragmented DNA from gene source nolecule 基因重组技术的 Gene insertion to vecto 两个基本目的 Vector Vector insertion 1直接利用基因 to bacterium Chromosome :◎ Gene 主导生长的基因 eProtein 作物的抗性基因 基因诊断、基因治疗、 Bacteria cloned 指纹图谱等 Genes Protein harvested 2利用基因的表达产物 疫苗、药物 Protein 组织激活物 Vaccines esistance 生长因子 Ani Tissue growt activator 珍稀蛋白等 Gene therapy Interferon DNA owth fingerprinting mg
基因重组技术的 两个基本目的 1.直接利用基因 主导生长的基因、 作物的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等 2.利用基因的表达产物 疫苗、药物、 组织激活物、 生长因子、 珍稀蛋白等
核酸酶学 50年来,核酸酶学的进步为DNA的分析与鉴定提供了有力的工具。主要的 核酸酶有: DNA聚合酶( DNA polymerase) klenow片段,Taq酶 限制性核酸内切酶( restriction endonuclease) 逆转录酶( Reverse transcriptase) S1核酸酶(S1 nuclease) 连接酶( Ligase) 拓扑异构酶( Topoisomerase)等
50年来，核酸酶学的进步为DNA的分析与鉴定提供了有力的工具。主要的 核酸酶有： DNA聚合酶（DNA polymerase ） klenow 片段， Taq 酶 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ） 逆转录酶（Reverse transcriptase） S1核酸酶（ S1 nuclease） 连接酶（Ligase） 拓扑异构酶（Topoisomerase）等 核酸酶学
限制性核酸内切酶—一一把神奇的“手术刀” 具有内切和甲基化两种功能 能够识别外源的核酸并将它切除 有特异的识别位点,通常为48对碱基的旋转对称结构 在其切口处留下黏性未端( sticky end)—具有互补序列 的单股链,或者平头未端( blunt end) 有3种类型,Ⅱ型为主 例如: EcORI 排序 属 种品系
限制性核酸内切酶—— 一把神奇的“手术刀” 具有内切和甲基化两种功能 能够识别外源的核酸并将它切除 有特异的识别位点，通常为4-8对碱基的旋转对称结构 在其切口处留下黏性末端（sticky end）——具有互补序列 的单股链，或者平头末端（blunt end） 有3种类型，II型为主 例如： EcoRI 属 种 品系 排序
Enzyme Recognition sequence Type of ends End sequences A 5′-AGCT3 Blunt 5′AGcT3 3′TCGA5 3′TCGA5′ Sau3Al 5′GATC3 Sticky, 3 overhang GATC-3 3′CTAG5′ 3′CTAG Hinf 5′ GANTO3′ Sticky, 3 overhang 5′-G ANTC-3 3′ CTNAC-5 3′CTNA G-5 5′- GGATCO3 Sticky. 3 overman 5-G GATCO3′ 3′ CCTAGG5 3′ CCTAG G-5 BsrBl 5′ CCGCTO3 Blunt 5′ NNNCCGCTO3 3’ GGCGAG5 3′. NNNGGCGAG5 EcoRI 5′ GAATTO3 Sticky, 3 overman 5-G AATTO3′ 3′ CTTAAG5′ 3-CTTAA G-5 Notl 5′ GCGGCCGO3 Sticky. 3 overhang 5′GC GGCCGC-3 3′ CGCCGGCG-5 3′ CGCCGG CG.5 5′ GCCNNNNNGGO Sticky, 5 overhang 5-GCCNNN NNGGC-3 3′ CGGNnnnncCG5′ 3′ CGGNN NNNCCG5′ NanynucleotideFordetailsofallknownrestrictionenzymesseeRebaSechttp://www.neb.com/rebase/rebase.htmp>. 限制性内切酶(有专一的切点并常在切口处留下黏性末端)
限制性内切酶（有专一的切点并常在切口处留下黏性末端）
目的基因克隆的技术路线 获得目的基因 选择合适的可以携带目的基因的载体 把目的基因插入到载体中去,得到重组载体 将重组载体导入宿主细胞进行克隆(通过无性繁殖,随着宿主目的基因 也得以扩增) 对重组的克隆进行筛选 使重组的宿主细胞大规模的表达目的基因
目的基因克隆的技术路线 获得目的基因 选择合适的可以携带目的基因的载体 把目的基因插入到载体中去，得到重组载体 将重组载体导入宿主细胞进行克隆（通过无性繁殖，随着宿主目的基因 也得以扩增） 对重组的克隆进行筛选 使重组的宿主细胞大规模的表达目的基因