生化奥验技术专题 主要内容和要求:以蛋白质分离纯化为例 介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和注意事 项;介绍层析技术、电泳技术、离心技术的原 理及其应用;总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸 测定的主要方法
生化实验技术专题 主要内容和要求：以蛋白质分离纯化为例 介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和注意事 项；介绍层析技术、电泳技术、离心技术的原 理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸 测定的主要方法
目录 第一节生物大分子物质的制备 第二节几种主要的生物化学实验技术 第三节生物分子的检测
第一节 生物大分子物质的制备 第二节 几种主要的生物化学实验技术 第三节 生物分子的检测
第一节生物大分子物质的制备 一般过程 材料的选择和处理 确立测定方法 细胞的破碎 有效成分的抽提 二.注意事项 有效成分的浓缩 纯化方案的设计和评价 例:宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化
第一节 生物大分子物质的制备 一．一般过程 二．注意事项 三．纯化方案的设计和评价 例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 •材料的选择和处理 •确立测定方法 •细胞的破碎 •有效成分的抽提 •有效成分的浓缩
生物大分子分离纯化的一般步骤 层析法 电泳法 生物组织→无细胞提取液→粗产品→却、过}→结晶 超滤 ←前处理→|←粗分级→ 细分级→ 材料选择与处理 盐析(硫酸铵盐析) 细胞破碎(机械破 等点电沉淀 碎、溶账和自溶、 有机溶剂沉淀 酶解、化学处理) 透析
生物大分子分离纯化的一般步骤 层析法 电泳法 超离心法 超滤 •盐析（硫酸铵盐析） •等点电沉淀 •有机溶剂沉淀 •透析 │←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│ •材料选择与处理 •细胞破碎（机械破 碎、溶账和自溶、 酶解、化学处理） 生物组织→无细胞提取液→粗产品→ →结晶
几种主要沉淀方法比较 方法 原理 优点 缺点 应用范围 操作筒便、分辨力差 成本低廉、纯化倍数蛋白质或 1.沉淀法蛋自质的对蛋白质低,蛋白质酶的分级 盐析作用 或酶有保沉淀中混沉淀和结 护作用,重杂大量盐|晶 复性较好分 对蛋自质|蛋白质、多 2.有机溶脱水作用操作简便:或酶有多糖等物 肽、核酸和 剂沉淀和降低介分辨力较性作用,成质的分级 法 电常数 强 本较高 沉淀 等电点、热 3.选择性变性和特强,高装|用范围烹分季物 质的沉淀 沉淀作用 多
调整硫酸铵溶液饱和度计算表 (硫酸铵最终浓度%饱和度) 1020253033|3540455055606570758090100 每升溶液需加入固体硫酸铵的克数 056114144176196209243277313351390430472516156162767 10578611813715018321625128326365406449494592694 29597819112315518925262300340382424520619 硫[251 304961931251581932302678307348390485583 酸[30 19306294127162198235273314356449546 铵[33 11214374107142177214252292333426522 起[35 316394129164200238278319411506 始[40 3163971321682052452853751469 浓[45 326599134171210250339431 度[50 336601137176214302392 [55 3367103141179264353 饱[6 3469105143227314 和[65 3470107190275 度 70 3572153|237 36115198 77157 90 79
注意事项 1.控制适当的pH 2.控制低温 3.注意提取过程中的溶液环境 4.防止提纯过程中丢失一些辅助因子或亚基
注意事项 1．控制适当的pH 2．控制低温 3．注意提取过程中的溶液环境 4．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基
宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 纯化步骤 总蛋白总活力比活力纯化倍数回收率 (mg (U) (U/mg蛋白) 、粗酶液 80 4320 54 100 2、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 83 3、醋酸钙沉淀 21 2980 141 69 4、盐析 4 1771 464 8.52 41 5、丙酮沉淀 1166 1104 20.29 7 6、结晶 0.12 130 1072 19.70
宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率 （mg） （U） （U/mg蛋白） （%） 1、粗酶液 80 4320 54 1 100 2、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 83 3、醋酸钙沉淀 21 2980 141 2.64 69 4、盐析 4 1771 464 8.52 41 5、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 27 6、结晶 0.12 130 1072 19.70 3
第二节几种重要的生物化学实验技术 层析技术 电泳技术 离心技术
一、层析技术 二 、电泳技术 三 、离心技术
层析技术( chromatography) 1.层析技术一般原理 2.层析技术分类及应用
1．层析技术一般原理 2．层析技术分类及应用
