生物化学与分子生物学实验蛋白质定量分析BCA法/双缩脲法
生物化学与分子生物学实验 蛋白质定量分析 BCA法/双缩脲法
分光光度法·定义：根据物质对光的吸收特性和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法·Lambert-Beer定律A=KLC
分光光度法 • 定义： 根据物质对光的吸收特性和吸收强度， 对物质进行定性和定量的分析方法。 • Lambert-Beer定律 A=KLC
Lambert-Beer定律·入射光强度为Io，透射光强度为ItIt·则透光度T=×100%lo·吸光度(A)或称光密度(OD)或称消光度(E)A= -lgTIoIA-KLC三?C：物质的浓度(mg/ml,mol/L)，L：光程（cm），K为吸光系数或消光系数
• 入射光强度为I0，透射光强度为It， • 则透光度 T= • 吸光度(A)或称光密度(OD)或称消光度(E) A= - lgT I0 It A=KLC 100% Io It Lambert-Beer 定律 C •C：物质的浓度(mg/ml, mol/L)，L：光程（cm），K为吸光系数或消光系数
波长的选择选择待测物质最大吸收峰的波长（入max）1.使被测溶液有的适当的光密度（0.1-0.7）2.干扰影响降至最低限度3.标准曲线在尽可能大的范围内接近直线
选择待测物质最大吸收峰的波长（lmax） 1.使被测溶液有的适当的光密度（0.1-0.7） 2.干扰影响降至最低限度 3.标准曲线在尽可能大的范围内接近直线 波长的选择
待测溶液的浓度计算·（1)利用吸光系数（消光系数）求出待测溶液的浓度（2)利用标准管法计算待测溶液的浓度·（3）利用标准曲线进行换算
待测溶液的浓度计算 • (1)利用吸光系数（消光系数）求出待测溶液的浓度 • (2)利用标准管法计算待测溶液的浓度 • (3)利用标准曲线进行换算
利用标准管法计算待测溶液的浓度·根据Lambert-beer定律：标准管：As=KLCs（下标S：标准液）待测管：AX=KLCx（下标X：待测液），L相等，温度相同，测定同一物质，所用单色光相同，则K相同，则：As/Ax=Cs/Cx即Cx=Ax/As·Cs：在实际操作中，常使待测管体积与标准管体积相等（以X代表测定管含量，S代表标准管含量）则：X=AX/AS·S·计算待测溶液浓度时，可根据测定时实际吸取的标准液的体积(Vs）和待测样品的体积(Vx），将上式演Ax.Cs.VS待测溶液浓度：Cx=变为：VxAS
• 根据Lambert-beer定律： 标准管：As=KLCs (下标S：标准液) 待测管：Ax=KLCx (下标X：待测液) • L相等，温度相同，测定同一物质，所用单色光相同，则K相同，则： As/Ax=Cs/Cx即Cx=Ax/As·Cs • 在实际操作中，常使待测管体积与标准管体积相等(以X代表测定管含量，S代表标准管含量)则： X=Ax/As·S • 计算待测溶液浓度时，可根据测定时实际吸取的标准液的体积(Vs)和待测样品的体积(Vx)，将上式演 变为： 待测溶液浓度：Cx= 利用标准管法计算待测溶液的浓度 Vx Vs Cs As Ax • •
标准曲线的绘制标准曲线作用判断所采用的呈色方法是否符合Lamber-1Beer定律判断测定过程中操作、仪器等误差的大小2确定该方法的可靠性3从斜率可以比较各种方法的灵敏度进行大批样品分析时，可省略多次计算，从4OD值直接查阅标准曲线求得被测物质浓度
标准曲线的绘制 标准曲线作用 判断所采用的呈色方法是否符合LamberBeer定律 判断测定过程中操作、仪器等误差的大小， 确定该方法的可靠性 从斜率可以比较各种方法的灵敏度 进行大批样品分析时，可省略多次计算，从 OD值直接查阅标准曲线求得被测物质浓度
标准曲线的作法1、标准液浓度的选择：标准液浓度选一般应能包括待测样品可能变异最低与最高值。5种浓度，成倍增加或等级增加。2、标准液测定：重复测定2-3次，求其平均值，减少误差
1、标准液浓度的选择：标准液浓度选择一般应能包 括待测样品可能变异最低与最高值。5种浓度，成 倍增加或等级增加。 2、标准液测定：重复测定2-3次，求其平均值，减 少误差 标准曲线的作法
标准曲线法仪器：2max:根据Lambert-Beer定律，日期：室温：A与C成正比0.5y=0.912xR2=0.88360.40.3配制一系列标准液"Ax0.2C1、C2、C3、C4、C5、在10. 11入max下，测相应的A1、A2、一Cx0.3A3、A4、A5.0.20.40.500.10.6C(mg/ml)
标准曲线法 根据Lambert-Beer定律， A与C成正比 配制一系列标准液 C1、C2、C3、 C4、C5、在 lmax下，测相应的A1、A2、 A3、 A4、 A5。 y = 0.912x R 2 = 0.8836 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 C(mg/ml) A 仪器: lmax: 日期: 室温: AX CX
光密度-浓度标准曲线图的绘制1.电脑作图。横轴为C，纵轴为OD值2.通过原点，尽可能使直线通过更多点，不在直线上的点尽量均匀地分布在直线两边3.坐标纸上注明实验项自名称，仪器型号，波长，日期，室温等
1.电脑作图。横轴为C，纵轴为OD值。 2.通过原点，尽可能使直线通过更多点，不在直线 上的点尽量均匀地分布在直线两边。 3.坐标纸上注明实验项目名称，仪器型号，波长， 日期，室温等。 光密度-浓度标准曲线图的绘制