生物化学与分子生物学实验小鼠肝糖代谢基因转录水平分析
生物化学与分子生物学实验
实验技术路线RNA提取逆转录正常组mouse肝胰岛素组PCR电泳
mouse 肝 正常组 胰岛素组 PCR 逆转录 RNA提取 实验技术路线 电泳
RNA提取实验原理萃取抽提裂解变性漂洗TRIZOL氯仿异丙醇异硫氰酸胍+苯酚裂解细胞，变性蛋白质促使RNA进入水相沉淀RNA：异丙醇与使RNA与蛋白质分离水互溶，而RNA与杂离心后可形成水相层将RNA释放到溶液中。和有机层。质不溶于异丙醇》RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。>水相层（无色）主要为RNA>有机层（粉色）主要为DNA和蛋白质
一、RNA提取——实验原理 裂解细胞，变性蛋白质， 使RNA与蛋白质分离， 将RNA释放到溶液中。 促使RNA进入水相， 离心后可形成水相层 和有机层。 ➢ RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。 ➢ 水相层（无色）主要为RNA ➢ 有机层（粉色）主要为DNA和蛋白质。 氯仿 TRIZOL 异硫氰酸胍 + 苯酚 裂解变性 萃取抽提 漂洗 沉淀RNA：异丙醇与 水互溶，而RNA与杂 质不溶于异丙醇。 异丙醇
RNA提取实验步骤1、新鲜肝组织（2倍芝麻大小）置EP管中，加200ulTrizol充分研磨后，补加800wlTrizol，枪头吹匀。加入200ul氯仿，剧烈震荡15秒4℃12000g离心15min。3、将上层水相移至洁净EP管中，加入500ul异丙醇倒混匀。4、4℃12000g离心10min弃水相，EP管开盖干燥，沉淀溶于5.50ulDEPC水中
2、加入200l 氯仿，剧烈震荡15秒， 4℃ 12000g离心15min。 3、将上层水相移至洁净EP管中，加入 500l异丙醇颠倒混匀。 4、4℃ 12000g离心10min。 5、弃水相，EP管开盖干燥，沉淀溶于 50l DEPC水中。 一、RNA提取——实验步骤 1、新鲜肝组织（2倍芝麻大小）置EP管中，加200l Trizol充分研磨后，补加800l Trizol，枪头吹匀
RNA的纯度A260/A280纯DNA1.8Protein纯RNAoos2.0Nucloic Acid蛋白质污染2.0·RNA已经水解成单核酸>2.2
RNA的纯度 A260/A280 1.8 • 纯DNA 2.0 • 纯RNA 2.0 • Tris作为缓冲液检测OD值 >2.2 • RNA已经水解成单核酸
RNA的纯度A260/A230·A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐（胍盐）等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。·如果RNA样品的A260/280=1-1.5，A260/230=1-1.5，那么污染原因就应该考虑是酚残留。·如果RNA样品的A260/280>=2，A260/230<1，那么污染原因就应该考虑是胍盐残留
RNA的纯度 A260/A230 • A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐（胍 盐）等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0 。 • 如果RNA样品的A260/280=1-1.5, A260/230=1-1.5，那 么污染原因就应该考虑是酚残留。 • 如果RNA样品的A260/280>=2，A260/230<1，那么污 染原因就应该考虑是胍盐残留
RNA的浓度测定1、测定：49.5ul+2.5ml双蒸水稀释后，紫外分光光度法测A260、A280、A230值2、计算并分析RNA浓度及纯度A=KLCC=A/KL（ds核酸K=0.02，ss核酸K=0.025,L为1cm）=A260/0.025×稀释倍数
RNA的浓度测定 1 、测定:49.5l+2.5ml双蒸水稀释后，紫外分光光度法测 A260、A280、A230值 2、计算并分析RNA浓度及纯度 A=KLC C=A/KL（ds核酸K=0.02，ss核酸K=0.025,L为1cm） =A260/0.025×稀释倍数
逆转录PCR二实验原理由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作逆转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR），由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成复制复制转录翻译M逆转录DNARNA蛋白质
二、逆转录PCR——实验原理 由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作逆转录 PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR），由 依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成
逆转录过程RNA模板逆转录酶RNA指导的DNA聚合酶）杂化双链RNaseH（RNA酶H)CDNA单链DNA（DNA指导的DNA聚合酶）逆转录酶双链cDNA
RNA模板 逆转录酶 （RNA指导的DNA聚合酶） 逆转录酶 （DNA指导的DNA聚合酶） R Nase H （RNA酶 H) RNA 杂化双链 DNA 单链DNA cDNA 双链cDNA 逆转录过程
逆转录PCR的原理组织或细胞→RNA提取AAAAAAA(A)3AAAAAAA(A)22poly(A）尾的mRNAAAAAAAA(A))CDNA合成随机引物oligo(dT)赢特异性引物量AAAAAAA(A))AAAAAAA(A))AAAAAAA(A)-NNN2TTTTTTTTAAAAAAA(A)2AAAAAAA(A)2GSPAAAAAAA(A)N.NNTTTTTTTTAAAAAAA(A))AAAAAAA(A)IAAAAAAA(A)NA-NTNTTTTTTTTPCR扩增
逆转录PCR的原理