实验一玻片、试管凝集试验 颗粒性抗原（细菌、螺旋体、红细胞等）与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒 可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutination reaction)或凝集试验。参与凝集 反应的抗原称为凝集原(Agglutinogen),抗体称为凝集素(Agglutinin)。细菌或其它凝集原都 带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。抗原与相应抗体相遇后可以发生特 异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时己有凝集的趋向，在电解 质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去 了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。 根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。 凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。 [目的要求] 1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。 2.掌握凝集试验的结果判定及判定标准。 3.熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。 [材料与试剂 1.玻板，载玻片，试管(1cmx8cm),试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头 (tip头)，牙签或火柴棒，记号笔。 2。灭菌的生理盐水，灭菌的0.%石炭酸生理盐水。 3.布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布 氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。 4.鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。 [实验内容及操作方法] (一)试管凝集试验 以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。 1.试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。如被检 血清有多份，对照只需做1份。 2.被检血清稀释：第1管加入2.3ml0.5%石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5ml 0.5%石炭酸生理盐水：然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2ml,加入第1管中，反复吹吸 5次混匀，吸取1.5l弃之，再吸取0.5ml加入第2管中，混匀后吸取0.5ml加入第3管，依此 类推至第4管，混匀后吸弃0.5ml(见表1-1)。该被检血清的稀释度分别是1：12.5、1：25、 1:50、1:100
实验一 玻片、试管凝集试验 颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒 可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutination reaction)或凝集试验。参与凝集 反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。细菌或其它凝集原都 带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。抗原与相应抗体相遇后可以发生特 异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解 质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去 了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。 根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。 凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。 [目的要求] 1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。 2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。 3. 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。 [材料与试剂] 1. 玻板，载玻片，试管（1cm x 8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头 （tip头），牙签或火柴棒，记号笔。 2. 灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。 3. 布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布 氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。 4. 鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。 [实验内容及操作方法] （一）试管凝集试验 以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。 1. 试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。如被检 血清有多份，对照只需做1份。 2. 被检血清稀释：第1管加入2.3 ml 0.5% 石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5 ml 0.5% 石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2 ml ，加入第1管中，反复吹吸 5次混匀，吸取1.5 ml 弃之，再吸取0.5 ml 加入第2管中，混匀后吸取0.5 ml 加入第3管，依此 类推至第4管，混匀后吸弃0.5 ml （见表1-1）。该被检血清的稀释度分别是1:12.5、1:25、 1:50、1:100
3.对照管制作：第5管中加0.5%石炭酸生理盐水0.5ml,第6管加1：25稀释的布氏杆菌病 阳性血清0.5ml,第7管加1：25稀释的布氏杆菌病阴性血清0.5ml 4.加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原用0.5%石炭酸生理盐水作1：20稀释，每支试管加0.5 ml。 5.感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37℃温箱中4-10h,取出后置室 温18-24h(或37℃温箱12-14h,取出后置室温2-4h:或37℃温箱中22-24h取出)，然后观察并记录 结果。 6。结果判定：判定结果时用”+“表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的 程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。 十+十十：100%抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀 物呈片状、块状或颗粒状。 十+十：75%抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。 (管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊)。 十十：50%抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集）。 十：25%抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。 一：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底中央出现规则 的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。 7.判定标准：能使50%抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。 牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于1：100，判为阳性，1：50的凝集价判为疑似反应（可 疑)：猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于1：50，判为阳性，1：25的凝集价判为疑似反应 (可疑)。 [注意事项] 1.实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结果。 2.结果判为可疑时，隔2-3周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。对同群 中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性：牛、羊重检仍为可疑者，可 判为阳性，或以补体结合反应核对。 (二)布氏杆菌病平板凝集试验 1.加血清：取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格(4cm2)，并注明被检血清号码，以100μL微量 可调加样器按下列量加被检血清于方格内，第1格80uL、第2格40uL、第3格20uL、第4格10如L。血清 用前需放室温，使其温度达20℃左右。每一份检样需换一个ti头。大规模检疫时，允许只用两个血 清量作试验，牛、马、骆驼用40uL和20μL；猪、山羊、绵羊、狗用80μL和40μL。 2。加抗原：每格加布氏杆菌病平板凝集抗原30L,滴在血清附近，而不与血清接触。从血清 量最少的一格起，用牙签将血清与抗原混匀，一份血清用一根牙签。抗原用前摇匀，并置室温使其
3. 对照管制作：第5管中加0.5% 石炭酸生理盐水0.5 ml ，第6管加1:25稀释的布氏杆菌病 阳性血清0.5 ml ，第7管加1:25稀释的布氏杆菌病阴性血清0.5 ml 。 4. 加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原用0.5% 石炭酸生理盐水作1:20稀释，每支试管加0.5 ml 。 5. 感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37℃温箱中4-10h，取出后置室 温18-24h（或37℃温箱12-14h，取出后置室温2-4h；或37℃温箱中22-24 h取出），然后观察并记录 结果。 6. 结果判定：判定结果时用"+"表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的 程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。 ＋＋＋＋：100％抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀 物呈片状、块状或颗粒状。 ＋＋＋：75％抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。 （管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。 ＋＋：50％抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集）。 ＋：25％抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。 －：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底中央出现规则 的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。 7. 判定标准：能使50% 抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。 牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于1:100，判为阳性，1:50的凝集价判为疑似反应（可 疑）；猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于1:50，判为阳性，1:25的凝集价判为疑似反应 （可疑）。 [注意事项] 1. 实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结果。 2. 结果判为可疑时，隔2-3周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。对同群 中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可 判为阳性，或以补体结合反应核对。 （二）布氏杆菌病平板凝集试验 1. 加血清：取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格（4cm2），并注明被检血清号码，以100mL微量 可调加样器按下列量加被检血清于方格内，第l格80mL、第2格40mL、第3格20mL、第4格10mL。血清 用前需放室温，使其温度达20℃左右。每一份检样需换一个tip头。大规模检疫时，允许只用两个血 清量作试验，牛、马、骆驼用40mL 和20mL ；猪、山羊、绵羊、狗用80mL和40mL。 2. 加抗原：每格加布氏杆菌病平板凝集抗原30mL，滴在血清附近，而不与血清接触。从血清 量最少的一格起，用牙签将血清与抗原混匀，一份血清用一根牙签。抗原用前摇匀，并置室温使其
温度达20℃左右。 3.作用：混和完毕后，将玻板置恒温箱中或采用别的办法适当加温，使温度达到30℃左右 3-5min内记录反应结果。 4.对照：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清以及生理盐水作对照。 5.结果判定：按下列标准记录反应结果。 十十十十：出现大的凝集块，液体完全透明，即100%凝集。 十十十：有明显凝集块，液体几乎完全透明，即75%凝集。 ++：有可见凝集块，液体不甚透明，即50%凝集。 十：液体混浊，有小的颗粒状物，即25%凝集。 一：液体均匀混浊，无凝集现象。 6.平板凝集试验与试管凝集试验的关系见实验指导表1-2。 7.判定标准：同试管凝集试验。 8.注意：对于阳性及可疑的被检血清需用试管凝集试验进行验证。 (三)虎红平板凝集试验 这种试验是快速平板凝集试验。抗原是布氏杆菌加虎红制成。虎红平板凝集试验可与试管凝集 试验及补体结合试验效果相比，具有操作简单、快速、特异性强的优点， 1.被检血清和布氏杆菌病虎红平板凝集抗原各30L滴于玻璃板的方格内，每份血清各用一支 牙签或火柴棒混合均匀。在室温(20℃)4-10min内记录反应结果。同时以阳、阴性血清作对照。 2。结果判定：在阳性血清及阴性血清试验结果正确的前提下，被检血清出现任何程度的凝集 现象均判为阳性，完全不凝集的判为阴性，无可疑反应。 3.注意：抗原用前充分摇匀，抗原和被检血清用前应放室温30-60min后再进行试验。 (四)鸡白痢平板凝集试验 1,被检鸡血清和鸡白痢平板凝集抗原各1滴（约30L)滴于玻板或载玻片上，用牙签或火柴棒 充分混合。 2.结果判定：在室温(20℃)下，观察30-60s,凝集者为阳性，不凝集者为阴性 [思考题] 1.凝集反应的原理是什么？ 2.哪些因素影响细菌凝集试验？ 3.凝集试验中为什么要设阳性、阴性血清及抗原对照？ 实验二琼脂扩散试验、对流免疫电泳
温度达20℃左右。 3. 作用：混和完毕后，将玻板置恒温箱中或采用别的办法适当加温，使温度达到30℃左右， 3-5min内记录反应结果。 4. 对照：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清以及生理盐水作对照。 5. 结果判定：按下列标准记录反应结果。 ＋＋＋＋：出现大的凝集块，液体完全透明，即100% 凝集。 ＋＋＋：有明显凝集块，液体几乎完全透明，即75% 凝集。 ＋＋：有可见凝集块，液体不甚透明，即50% 凝集。 ＋：液体混浊，有小的颗粒状物，即25% 凝集。 －：液体均匀混浊，无凝集现象。 6. 平板凝集试验与试管凝集试验的关系见实验指导表1-2。 7. 判定标准：同试管凝集试验。 8. 注意：对于阳性及可疑的被检血清需用试管凝集试验进行验证。 （三）虎红平板凝集试验 这种试验是快速平板凝集试验。抗原是布氏杆菌加虎红制成。虎红平板凝集试验可与试管凝集 试验及补体结合试验效果相比，具有操作简单、快速、特异性强的优点。 1. 被检血清和布氏杆菌病虎红平板凝集抗原各30mL滴于玻璃板的方格内，每份血清各用一支 牙签或火柴棒混合均匀。在室温（20℃）4-10min内记录反应结果。同时以阳、阴性血清作对照。 2. 结果判定：在阳性血清及阴性血清试验结果正确的前提下，被检血清出现任何程度的凝集 现象均判为阳性，完全不凝集的判为阴性，无可疑反应。 3. 注意：抗原用前充分摇匀，抗原和被检血清用前应放室温30-60min后再进行试验。 （四）鸡白痢平板凝集试验 1. 被检鸡血清和鸡白痢平板凝集抗原各1滴（约30mL）滴于玻板或载玻片上，用牙签或火柴棒 充分混合。 2. 结果判定：在室温（20℃）下，观察30-60s，凝集者为阳性，不凝集者为阴性。 [思考题] 1. 凝集反应的原理是什么? 2. 哪些因素影响细菌凝集试验? 3. 凝集试验中为什么要设阳性、阴性血清及抗原对照？ 实验二 琼脂扩散试验、对流免疫电泳
可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料浸出液、病毒、血清以及其他来源的蛋白质、多糖、类脂 等)与其相应的抗体结合后，在电解质参与下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀反应 (Precipitation reaction)。沉淀反应中的抗原称为沉淀原(Precipitinogen),抗体称为沉淀素 (Precipitin)。 沉淀反应主要包括有琼脂扩散沉淀试验及免疫电泳等。 [目的要求] 1,掌握琼脂扩散沉淀试验的原理和操作方法。 2.了解对流免疫电泳的一般原理和操作技术。 [材料与试剂] 1.口径0.4cm的小试管，毛细滴管，载玻片，平皿，烧杯没，打孔器，针头，酒精灯，加样器 (移液器)，滴头，电泳槽，电泳仪等。 2.生理盐水，8.5%NaC1溶液，0.5%石炭酸生理盐水，巴比妥缓冲液，琼脂粉等 3.禽流感琼扩抗原，禽流感阳性血清，待检鸡血清：兔抗猪1gG,猪血清，鸡血清，兔血清、 牛血清，羊血清等。 4.小鹅瘟琼扩抗原，小鹅瘟抗血清：鸡传染性法氏囊病琼扩抗原（或待检法氏囊组织浸提 液)，鸡传染性法氏囊病阳性血清。 [实验内容及操作方法] (一)琼脂扩散沉淀试验 琼脂扩散沉淀试验(Agar gel precipitation test,AGPT)是沉淀反应的一种形式。物质自由 运动形成扩散现象，扩散可以在各种介质中进行。1%琼脂凝胶形成网状构架，空隙中是 98%-99%的水，允许分子量在200ku以下分子通过。绝大多数可溶性抗原和抗体的分子量在200ku以 下，因此可以在琼脂凝胶中自由扩散，所受阻力甚小。二者在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处结合 成复合物，此复合物因颗粒较大而不能扩散，故形成沉淀带。 本试验可用已知抗体检测样品中的抗原，也可用已知抗原检测血清样品中的抗体。 1.琼脂板制备：称取1g琼脂粉，加入100ml生理盐水或8.5%NaC1溶液（禽类），煮沸使之 溶解。待溶解的琼脂温度降至60℃左右时倒入平皿中，厚度为2-3mm。 2.打孔：用打孔器在琼脂凝胶板上按7孔梅花图案打孔，孔径约3-5mm,中心孔和周围孔间的 距离约为3-5m。挑出孔内琼脂凝胶，注意不要挑破孔的边缘。 3.封底：在火焰上缓缓加热，使孔底琼脂凝胶微微融化，以防止孔底边缘渗漏。 4.加样：以毛细滴管（或加样器）将样品加入孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。 (1)血清流行病学调查：将禽流感琼扩抗原置中心孔，周围1、3、5孔加禽流感阳性血清，2、 4、6孔分别加待检鸡血清，每加一个样品应换一个滴头
可溶性抗原(如细菌浸出液、含菌病料浸出液、病毒、血清以及其他来源的蛋白质、多糖、类脂 等)与其相应的抗体结合后，在电解质参与下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀反应 (Precipitation reaction)。 沉淀反应中的抗原称为沉淀原（Precipitinogen），抗体称为沉淀素 （Precipitin）。 沉淀反应主要包括有琼脂扩散沉淀试验及免疫电泳等。 [目的要求] 1. 掌握琼脂扩散沉淀试验的原理和操作方法。 2. 了解对流免疫电泳的—般原理和操作技术。 [材料与试剂] 1. 口径0.4cm的小试管，毛细滴管，载玻片，平皿，烧杯没，打孔器，针头，酒精灯，加样器 （移液器），滴头，电泳槽，电泳仪等。 2. 生理盐水，8.5% NaCl溶液，0.5% 石炭酸生理盐水，巴比妥缓冲液，琼脂粉等。 3. 禽流感琼扩抗原，禽流感阳性血清，待检鸡血清；兔抗猪IgG，猪血清，鸡血清，兔血清、 牛血清，羊血清等。 4. 小鹅瘟琼扩抗原，小鹅瘟抗血清；鸡传染性法氏囊病琼扩抗原（或待检法氏囊组织浸提 液），鸡传染性法氏囊病阳性血清。 [实验内容及操作方法] （一）琼脂扩散沉淀试验 琼脂扩散沉淀试验（Agar gel precipitation test，AGPT）是沉淀反应的一种形式。物质自由 运动形成扩散现象，扩散可以在各种介质中进行。1% 琼脂凝胶形成网状构架，空隙中是 98%-99% 的水，允许分子量在200ku以下分子通过。绝大多数可溶性抗原和抗体的分子量在200ku以 下，因此可以在琼脂凝胶中自由扩散，所受阻力甚小。二者在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处结合 成复合物，此复合物因颗粒较大而不能扩散，故形成沉淀带。 本试验可用已知抗体检测样品中的抗原，也可用已知抗原检测血清样品中的抗体。 1. 琼脂板制备：称取1g琼脂粉，加入100ml 生理盐水或8.5% NaCl溶液（禽类），煮沸使之 溶解。待溶解的琼脂温度降至60℃左右时倒入平皿中，厚度为2-3mm。 2. 打孔：用打孔器在琼脂凝胶板上按7孔梅花图案打孔，孔径约3-5mm，中心孔和周围孔间的 距离约为3-5mm。挑出孔内琼脂凝胶，注意不要挑破孔的边缘。 3. 封底：在火焰上缓缓加热，使孔底琼脂凝胶微微融化，以防止孔底边缘渗漏。 4. 加样：以毛细滴管（或加样器）将样品加入孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。 （1）血清流行病学调查：将禽流感琼扩抗原置中心孔，周围1、3、5孔加禽流感阳性血清，2、 4、6孔分别加待检鸡血清，每加一个样品应换一个滴头
(2)抗血清效价测定：将猪血清（抗原）加入中心孔，将兔抗猪1gG(抗体)作2倍比稀释， 即1：2、1：4、1：8、1：16、1：32等，分别加至周围孔中。或者是将小鹅瘟琼扩抗原加入中心孔，周 围孔加入1：2、1：4、1：8、1：16、1：32等稀释的小鹅瘟抗血清。 (3)抗原检测：将兔抗猪1gG(抗血清)加入中心孔，将待测抗原（猪血清、鸡血清、兔血 清、牛血清、羊血清等)置于周围孔中。或者是将鸡传染性法氏囊病阳性血清加入中心孔，周围孔 加鸡传染性法氏囊病琼扩抗原（或待检法氏囊组织浸提液）。 5.感作：将琼脂凝胶板加盖保湿，置于37℃温箱，24-48h后，判定结果。 6.结果判定 (1)血清流行病学调查：待检孔与阳性孔出现的沉淀带完全融合者判为阳性。待检血清无沉淀 带或所出现的沉淀带与阳性对照的沉淀带完全交叉者判为阴性。 (2)抗血清效价测定：以出现沉淀带的血清最高稀释倍数为抗血清的AGP效价。 (3)抗原检测：兔抗猪1gG与猪血清孔之间有明显沉淀带，与其他血清孔之间不形成沉淀带。 鸡传染性法氏囊病阳性血清与鸡传染性法氏囊病琼扩抗原孔之间出现沉淀带，如与待组织浸提液孔 之间出现沉淀带，说明该法氏囊组织中有鸡传染性法氏囊病病毒抗原。 (二)对流免疫电泳 在H值86的琼脂凝胶中，抗体球蛋白带有微弱的负电荷，在电泳时，由于电渗作用的影响，抗 体球蛋白反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质带负电荷，在电泳力的作用下向正极移动。二者在两 孔之间相遇，形成肉眼可见的白色沉淀线。 本法由于抗原抗体分子在电场作用下定向运动，限制了自由扩散，从而提高了敏感性，它较琼 脂扩散试验敏感性高10-16倍，并可大大缩短沉淀线出现的时间，适用于快速诊断。 1.琼脂板制备：用巴比妥缓冲液配制1%-1.5%琼脂凝胶板，厚度2-3mm。 2.打孔：孔径3-5mm,孔距4-10mm,一张载玻片可打12个孔，挑去孔内琼脂，封底。 3.加样：一对孔中，一孔加己知（或待测）抗原，另一孔加待测（或己知）抗体。 4。电泳：在电泳槽内加入p8.6的巴比妥缓冲液，将滤纸片放入缓冲液内浸湿搭桥。将抗原 孔置于负极端。电压2.5-6V/cm,或电流强度3-5A/cm,电泳时间为30-90min。 5。结果观察：断电后，将凝胶板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者则在抗原与抗体孔 之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。如沉淀线不清晰，可将琼脂凝胶板放在湿盒中37℃数小时或 置电泳槽过夜再观察。 [思考题] 1.琼脂扩散沉淀试验的操作方法及其应用。 2.对流免疫电泳的原理是什么？ 实验三间接血凝实验
（2）抗血清效价测定：将猪血清（抗原）加入中心孔，将兔抗猪IgG（抗体）作2倍比稀释， 即 l:2、1:4、1:8、l:16、1:32等，分别加至周围孔中。或者是将小鹅瘟琼扩抗原加入中心孔，周 围孔加入l:2、1:4、1:8、l:16、1:32等稀释的小鹅瘟抗血清。 （3）抗原检测：将兔抗猪IgG（抗血清）加入中心孔，将待测抗原（猪血清、鸡血清、兔血 清、牛血清、羊血清等）置于周围孔中。或者是将鸡传染性法氏囊病阳性血清加入中心孔，周围孔 加鸡传染性法氏囊病琼扩抗原（或待检法氏囊组织浸提液）。 5. 感作：将琼脂凝胶板加盖保湿，置于37℃温箱，24-48h后，判定结果。 6. 结果判定 （1）血清流行病学调查：待检孔与阳性孔出现的沉淀带完全融合者判为阳性。待检血清无沉淀 带或所出现的沉淀带与阳性对照的沉淀带完全交叉者判为阴性。 （2）抗血清效价测定：以出现沉淀带的血清最高稀释倍数为抗血清的AGP效价。 （3）抗原检测：兔抗猪IgG与猪血清孔之间有明显沉淀带，与其他血清孔之间不形成沉淀带。 鸡传染性法氏囊病阳性血清与鸡传染性法氏囊病琼扩抗原孔之间出现沉淀带，如与待组织浸提液孔 之间出现沉淀带，说明该法氏囊组织中有鸡传染性法氏囊病病毒抗原。 （二）对流免疫电泳 在pH值8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白带有微弱的负电荷，在电泳时，由于电渗作用的影响，抗 体球蛋白反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质带负电荷，在电泳力的作用下向正极移动。二者在两 孔之间相遇，形成肉眼可见的白色沉淀线。 本法由于抗原抗体分子在电场作用下定向运动，限制了自由扩散，从而提高了敏感性，它较琼 脂扩散试验敏感性高10-16倍，并可大大缩短沉淀线出现的时间，适用于快速诊断。 1. 琼脂板制备：用巴比妥缓冲液配制1%-1.5% 琼脂凝胶板，厚度2-3mm。 2. 打孔：孔径3-5mm，孔距4-10mm，一张载玻片可打12个孔，挑去孔内琼脂，封底。 3. 加样：一对孔中，一孔加已知（或待测）抗原，另一孔加待测（或已知）抗体。 4. 电泳：在电泳槽内加入pH 8.6的巴比妥缓冲液，将滤纸片放入缓冲液内浸湿搭桥。将抗原 孔置于负极端。电压2.5-6V/cm，或电流强度3-5mA/cm，电泳时间为30-90min 。 5. 结果观察：断电后，将凝胶板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者则在抗原与抗体孔 之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。如沉淀线不清晰，可将琼脂凝胶板放在湿盒中37℃数小时或 置电泳槽过夜再观察。 [思考题] 1. 琼脂扩散沉淀试验的操作方法及其应用。 2. 对流免疫电泳的原理是什么？ 实验三 间接血凝实验
间接血凝试验(indirect haemagglutination test,IHAT)亦称被动血凝试验(passive haemagglutination assay,PHA),是将可溶性抗原致敏于红细胞表面，用以检测相应抗体，在与相 应抗体反应时出现肉眼可见凝集。如将抗体致敏于红细胞表面，用以检测样本中相应抗原，致敏红 细胞在与相应抗原反应时发生凝集，称为反向间接血凝试验(reverse passive heamagglutination assay,.RPHA)。 [目的要求] 1.掌握间接血凝试验的原理、操作方法及结果判定。 2.了解红细胞致敏的方法。 [材料与试剂们 1.红细胞，常用绵羊红细胞及人0型红细胞： 2.96孔聚苯乙烯塑料反应板： 3。已知抗原、待检血清、标准阳性血清与阴性血清： 4.醛化剂（戊二醛）： 5.0.2%p5.2醋酸缓冲液： 6.0.11mol/LpH7.2PS液。 [实验内容及操作方法] 1.醛化SRBC的制备无菌采集绵羊血，玻璃珠脱纤抗凝，沉集绵羊红细胞用10~20倍体 积的0.11mol/LpH7.2PBS洗涤4~6次，最终配成10%细胞悬液，预冷到4℃后放于冰箱，缓慢加入 等量的1%戊二醛（用0.11mol/LpH7.2PBS配制）并继续摇动30~60min,然后用PBS洗5次，最后用 PBS配成10%的悬液，加入0.01%NaN3防腐，4℃冰箱保存备用。 2.醛化SRBC的致敏 (1)用0.11mol/LpH7.2PBS将10%的醛化红细胞洗涤2次，每次以3000r/min离心10min, 最后用0.2%p5.2醋酸缓冲液配制成5%的悬液，置于37℃水浴中预热。 (2)以0.2%p5.2醋酸缓冲液稀释抗原（最适浓度经预试验确定），置于37℃水浴中预热。 (3)在5%红细胞悬液中加入等体积的抗原溶液混匀，置37℃水浴中作用30min,每隔5min振 荡混匀一次。 (4)以3000r/min离心10min,用稀释液将致敏红细胞洗涤3次，最后配成1%致敏红胞悬液，备 用。 3.间接血凝试验（微量法）的具体操作步骤 (1)用微量加样器在V型血凝板上每孔加入25uL稀释液。 (2)取25uL待检血清加入到第1孔，混合4或5次，取出25uL置入第2孔进行混匀，依次到第11 孔，取出25L弃掉。第12孔留作红细胞对照，同时设立阳性血清与阴性血清对照
间接血凝试验(indirect haemagglutination test，IHAT)亦称被动血凝试验(passive haemagglutination assay，PHA)，是将可溶性抗原致敏于红细胞表面，用以检测相应抗体，在与相 应抗体反应时出现肉眼可见凝集。如将抗体致敏于红细胞表面，用以检测样本中相应抗原，致敏红 细胞在与相应抗原反应时发生凝集，称为反向间接血凝试验(reverse passive heamagglutination assay，RPHA)。 [目的要求] 1．掌握间接血凝试验的原理、操作方法及结果判定。 2．了解红细胞致敏的方法。 [材料与试剂] 1．红细胞，常用绵羊红细胞及人O型红细胞； 2．96孔聚苯乙烯塑料反应板； 3．已知抗原、待检血清、标准阳性血清与阴性血清； 4．醛化剂(戊二醛)； 5．0.2％ pH5.2醋酸缓冲液； 6．0.11mol／L pH7.2 PBS液。 [实验内容及操作方法] 1．醛化SRBC的制备 无菌采集绵羊血，玻璃珠脱纤抗凝，沉集绵羊红细胞用10～20倍体 积的0.11mol／L pH7.2 PBS洗涤4～6次，最终配成10％细胞悬液，预冷到4℃后放于冰箱，缓慢加入 等量的1％戊二醛(用0.11mol／L pH7.2 PBS配制)并继续摇动30～60min，然后用PBS洗5次，最后用 PBS配成10％的悬液，加入0.01％NaN3防腐，4℃冰箱保存备用。 2．醛化SRBC的致敏 (1)用0.11mol／L pH7.2 PBS将10％的醛化红细胞洗涤2次，每次以3000r／min离心10min， 最后用0.2％ pH5.2醋酸缓冲液配制成5％的悬液，置于37℃水浴中预热。 (2)以0.2％ pH5.2醋酸缓冲液稀释抗原(最适浓度经预试验确定)，置于37℃水浴中预热。 (3)在5％红细胞悬液中加入等体积的抗原溶液混匀，置37℃水浴中作用30min，每隔5min振 荡混匀一次。 (4)以3000r／min离心10min，用稀释液将致敏红细胞洗涤3次，最后配成1％致敏红胞悬液，备 用。 3．间接血凝试验(微量法)的具体操作步骤 (1)用微量加样器在V型血凝板上每孔加入25mL稀释液。 (2)取25mL待检血清加入到第1孔，混合4或5次，取出25mL置入第2孔进行混匀，依次到第11 孔，取出25mL弃掉。第12孔留作红细胞对照，同时设立阳性血清与阴性血清对照
(3)将血凝板置于微量振荡器上振荡lmin。 (4)每孔加入25uL抗原致敏红细胞，在振荡器上振荡混匀，置于室温或37℃反应45~60min,观察 结果 [结果判定] 红细胞呈薄层凝集，布满整个孔底或边缘卷曲呈荷叶边状为100%凝集，记录为“++“或“#”：红 细胞呈薄层凝集，但面积较小，中心较致密，边缘松散，即为50%凝集，记录为”+“：介于上述两 者之间为75%凝集，记录为“++”；红细胞大部分集中于中央，周围有少量凝集为25%凝集，记录 为”+”。红细胞沉底呈圆点状，周围光滑，无分散凝集为0%凝集，记录为”一”。以出现50%凝集的 血清的最高稀释度作为该血清的间接血凝效价。 [注意事项] l.红细胞的选择和处理常用绵羊红细胞(sheep red blood eell,.SRBC)及人0型红细 胞。SRBC较易大量获取，血凝图谱清晰，制剂稳定，但绵羊可能有个体差异，以固定一头羊采血为 宜。更换羊时应预先进行比较和选择。此外，待测血清中有异嗜性抗体时易出现非特异性凝集，需 事先以SBC进行吸收。人0型红细胞很少出现非特异性凝集，采血后可立即使用，也可4份血加1份阿 氏液（含8.0g/L枸橼酸三钠、19.0g/L葡萄糖、4.2g/LNaC1)混匀后置4℃，1周内使用。 2.新鲜红细胞与醛化红细胞的特点新鲜红细胞用阿氏液保存于4℃，可供3周内使用， 但用新鲜红细胞致敏后，保存时间短，而且不同动物个体和不同批次来源的红细胞均有差异，影响 试验结果和分析。为了克服这一缺点，目前多采用醛化红细胞或鞣化红细胞。 3.红细胞醛化及其优点常见的醛化剂有甲醛、戊二醛和丙酮醛。醛化红细胞的优点主 要体现在：①性质稳定，不影响红细胞表面的吸附能力：②重复性好，易标准化：③可较长期保 存，醛化后4℃保存，有效期可至1年，如冻干保存，有效期则更长。 4.影响醛化的因素①红细胞的洁净程度：由于红细胞表面残留血浆蛋白和其他胶质 易引起自家凝集，所以一定要充分洗净：②红细胞的浓度：醛化时应尽量使红细胞稀释度低一些， 以减少红细胞的凝集和变形：③醛化时的温度：与醛化红细胞的质量有很大关系，一般最好是 37℃，但有人认为应于4℃进行醛化：④醛化剂的浓度和醛化次数：醛化剂的浓度过大易引起红细胞 皱褶，浓度过低又会增加溶血机会，所以一般以3%醛化浓度为宜。家禽红细胞一般醛化1或2次即 可，而哺乳动物红细胞醛化2次比醛化1次要好，敏感性高，保存时间也长。 5.影响红细胞致敏的因素 (①)要有高纯度或高效价的抗原或抗体。 (②)被致敏抗原或抗体剂量和浓度要适当。抗猪瘟IgG一般用80~160μg/L,抗口蹄疫IgG 20~40μg/mL,抗猪水疱病1gG130~160μg/mL,抗猪肺疫1gG30~40μg/L,抗猪弓形体20 ~40μg/mL,抗原一般用0.2~1.0mg/l
(3)将血凝板置于微量振荡器上振荡1min。 (4)每孔加入25mL抗原致敏红细胞，在振荡器上振荡混匀，置于室温或37℃反应45～60min，观察 结果。 [结果判定] 红细胞呈薄层凝集，布满整个孔底或边缘卷曲呈荷叶边状为100％凝集，记录为"++++"或"#"；红 细胞呈薄层凝集，但面积较小，中心较致密，边缘松散，即为50％凝集，记录为"++"；介于上述两 者之间为75％凝集，记录为"+++"；红细胞大部分集中于中央，周围有少量凝集为25％凝集，记录 为"+"。红细胞沉底呈圆点状，周围光滑，无分散凝集为0％凝集，记录为"－"。以出现50％凝集的 血清的最高稀释度作为该血清的间接血凝效价。 [注意事项] 1．红细胞的选择和处理 常用绵羊红细胞(sheep red blood eell，SRBC)及人O型红细 胞。SRBC较易大量获取，血凝图谱清晰，制剂稳定，但绵羊可能有个体差异，以固定一头羊采血为 宜。更换羊时应预先进行比较和选择。此外，待测血清中有异嗜性抗体时易出现非特异性凝集，需 事先以SRBC进行吸收。人O型红细胞很少出现非特异性凝集，采血后可立即使用，也可4份血加1份阿 氏液(含8.Og/L枸橼酸三钠、19.Og/L葡萄糖、4.2g/L NaCl)混匀后置4℃，1周内使用。 2．新鲜红细胞与醛化红细胞的特点 新鲜红细胞用阿氏液保存于4℃，可供3周内使用， 但用新鲜红细胞致敏后，保存时间短，而且不同动物个体和不同批次来源的红细胞均有差异，影响 试验结果和分析。为了克服这一缺点，目前多采用醛化红细胞或鞣化红细胞。 3．红细胞醛化及其优点 常见的醛化剂有甲醛、戊二醛和丙酮醛。醛化红细胞的优点主 要体现在：①性质稳定，不影响红细胞表面的吸附能力；②重复性好，易标准化；③可较长期保 存，醛化后4℃保存，有效期可至1年，如冻干保存，有效期则更长。 4．影响醛化的因素 ①红细胞的洁净程度：由于红细胞表面残留血浆蛋白和其他胶质， 易引起自家凝集，所以一定要充分洗净；②红细胞的浓度：醛化时应尽量使红细胞稀释度低一些， 以减少红细胞的凝集和变形；③醛化时的温度：与醛化红细胞的质量有很大关系，一般最好是 37℃，但有人认为应于4℃进行醛化；④醛化剂的浓度和醛化次数：醛化剂的浓度过大易引起红细胞 皱褶，浓度过低又会增加溶血机会，所以一般以3％醛化浓度为宜。家禽红细胞一般醛化1或2次即 可，而哺乳动物红细胞醛化2次比醛化1次要好，敏感性高，保存时间也长。 5．影响红细胞致敏的因素 (1)要有高纯度或高效价的抗原或抗体。 (2)被致敏抗原或抗体剂量和浓度要适当。抗猪瘟IgG一般用80～160mg／mL，抗口蹄疫IgG 20～40mg／mL，抗猪水疱病IgG 130～160 mg／mL，抗猪肺疫IgG 30～40 mg／mL，抗猪弓形体20 ～40mg/mL，抗原一般用O.2～1.O mg／mL
(3)除鸡卵蛋白pH值采用4.6~5.1外，其他通常采用5.6~6.4，高于7.2或低于4.6均可使红 细胞发生自凝。 (4)致敏温度一般为37℃，范围是20~40℃。 (5)致敏时间一般采用30min为最适时间，具有良好的特异性和重复性。也有采用60min。 时问过长，会造成红细胞的形态不整、反应结果紊乱等。 (6)血细胞浓度一般为1%，范围为0.5%~1.5%。 6.聚苯乙烯塑料反应板的选择和处理血凝反应均在96孔微量血凝反应板上进行。反应 板有2种，一种是U型孔，一种是V型孔。一般认为V型孔凝集图谱清晰，阳性与阴性易于区别。V型孔 的角度应小于90°。反应板用前应冲洗干净，使用一段时间后应以7ol/L尿素溶液浸泡（也可用50 ~100g/L次氯酸钠、含40g/L胃蛋白酶的4%HC1或10~20g/L加酶洗衣粉溶液)，以消除非特异性 凝集。 7.对参与反应的抗原与抗体的要求 间接血凝试验时，致敏用的抗原（如细菌或病毒）应 纯化，以保证所测抗体的特异性。细菌应进行裂解或浸提，某些抗原物质性质不明或提纯不易时， 也可用粗制的器官或组织浸出液：做反向间接血凝试验时，致敏用的抗体本身应具备高效价、高特 异性、高亲和力，一般情况下可用50%、33%饱和硫酸铵盐析法提取抗血清的Y球蛋白组分用于致 敏。为提高敏感性，可进一步经离子交换层析技术提取IgG,甚至再经抗原免疫亲和层析纯化，提取 有抗体活性的1gG组分。将IgG用胃蛋白酶消化，制成F(b')2片段用于致敏，可消除一些非特异性 因素。 [临床应用] (1)测定非传染病的抗体或抗原，如类风湿抗体、自身抗体、变态反应性抗体、激素抗体、 肝癌抗原。 (②)测定传染病的抗体或抗原，己经用于一些细菌、螺旋体、支原体、病毒等传染病的抗体 检测和抗原的检测，如兽医临床上常用己知猪瘟病毒血凝抗原检测待检血清中的猪瘟抗体（属于正向 间接血凝试验)。 (3)测定寄生虫病和原虫病的抗体。 (④)测定抗毒素及外毒素，如白喉抗毒素、破伤风抗毒素的测定以及金黄色葡萄球菌肠毒素 和A、B、C、E型肉毒毒素。 [思考题] (1)正向间接血凝反应与反向间接血凝反应有何不同？ (②)间接血凝反应中哪些情况可能出现假阳性反应？ 实验四荧光抗体实验
(3)除鸡卵蛋白pH值采用4.6～5.1外，其他通常采用5.6～6.4，高于7.2或低于4.6均可使红 细胞发生自凝。 (4)致敏温度一般为37℃，范围是20～40℃。 (5)致敏时间一般采用30 min为最适时间，具有良好的特异性和重复性。也有采用60 min。 时问过长，会造成红细胞的形态不整、反应结果紊乱等。 (6)血细胞浓度一般为1％，范围为0.5％～1.5％。 6．聚苯乙烯塑料反应板的选择和处理 血凝反应均在96孔微量血凝反应板上进行。反应 板有2种，一种是U型孔，一种是V型孔。一般认为V型孔凝集图谱清晰，阳性与阴性易于区别。V型孔 的角度应小于90°。反应板用前应冲洗干净，使用一段时间后应以7 mol/L尿素溶液浸泡(也可用50 ～100 g/L次氯酸钠、含40 g/L胃蛋白酶的4％HCl或10～20 g／L加酶洗衣粉溶液)，以消除非特异性 凝集。 7．对参与反应的抗原与抗体的要求 间接血凝试验时，致敏用的抗原(如细菌或病毒)应 纯化，以保证所测抗体的特异性。细菌应进行裂解或浸提，某些抗原物质性质不明或提纯不易时， 也可用粗制的器官或组织浸出液；做反向间接血凝试验时，致敏用的抗体本身应具备高效价、高特 异性、高亲和力，一般情况下可用50％、33％饱和硫酸铵盐析法提取抗血清的γ球蛋白组分用于致 敏。为提高敏感性，可进一步经离子交换层析技术提取IgG，甚至再经抗原免疫亲和层析纯化，提取 有抗体活性的IgG组分。将IgG用胃蛋白酶消化，制成F(ab’)2片段用于致敏，可消除一些非特异性 因素。 [临床应用] (1)测定非传染病的抗体或抗原，如类风湿抗体、自身抗体、变态反应性抗体、激素抗体、 肝癌抗原。 (2)测定传染病的抗体或抗原，已经用于一些细菌、螺旋体、支原体、病毒等传染病的抗体 检测和抗原的检测，如兽医临床上常用已知猪瘟病毒血凝抗原检测待检血清中的猪瘟抗体(属于正向 间接血凝试验)。 (3)测定寄生虫病和原虫病的抗体。 (4)测定抗毒素及外毒素，如白喉抗毒素、破伤风抗毒素的测定以及金黄色葡萄球菌肠毒素 和A、B、C、E型肉毒毒素。 [思考题] (1)正向间接血凝反应与反向间接血凝反应有何不同? (2)间接血凝反应中哪些情况可能出现假阳性反应? 实验四 荧光抗体实验
荧光抗体技术是指用荧光素对抗原或抗体进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分 析示踪相应的抗原或抗体的方法。该技术将血清学的特异性和敏感性与显微技术的精确性结合起 来，解决了生物学上的许多难题，如病毒的侵袭途径及其感染细胞内复制部位的研究，以及抗体的 产生部位等。随着荧光抗体技术的敏感性和特异性的进一步提高，该技术在病原微生物的早期诊 断、肿瘤抗原的研究、抗原抗体免疫组化定位等方面得到了广泛应用。 [目的要求] 1.掌握荧光抗体染色法诊断猪瘟的基本操作步骤。 2.了解荧光抗体技术的基本原理。 [材料与试剂们 1.载玻片，盖玻片，冰冻切片机，荧光显微镜， 2.0.01mol/L PBS (pH7.2). 3.缓冲甘油：优级纯甘油9份和碳酸盐缓冲液1份混合而成。 4.碳酸盐缓冲液：0.5mol/L碳酸钠1份与0.5mol/L碳酸氢钠3份混合。 5.猪瘟荧光抗体，猪瘟抗血清，病猪的扁桃体或肾脏等。 [操作方法] 1,切片制备：将冰冻的扁桃体或肾脏进行切片，置载玻片上，空气中自然干燥后，立刻在室 温下放入纯丙酮固定15min。 2.洗涤：将固定好的切片以PBs轻轻漂洗5次，每次3min。 3.染色：在晾干的标本片上滴加猪瘟荧光抗体（工作浓度），以覆盖为度，放湿盒内置37℃ 染色30min. 4.洗涤：取出标本片，以吸管吸PBS冲去玻片中的荧光抗体，然后置大量PBS中漂洗5次，每次 3min,再以蒸馏水冲洗晾干。 5.封载：染色片半干时，滴加缓冲甘油封片。 本试验需设定以下对照： (1)阳性对照：含有猪瘟病毒的组织所作的切片： (2)自发荧光对照，以PBS代替荧光抗体染色： (3)抑制试验对照，标本上加未标记的猪瘟抗血清，37℃于湿盒内中30mi后，PBS漂洗，再 加标记抗体，染色同上。 6。镜检：将染色后的标本片置荧光显微镜下观察，先用低倍物镜选择适当的标本区，然后换 高倍物镜观察。以油镜观察时，可用缓冲甘油代替香柏油。 7.结果判定 阳性对照应呈翠绿色荧光，而猪瘟自发荧光对照组和抑制试验对照组应无荧光
荧光抗体技术是指用荧光素对抗原或抗体进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分 析示踪相应的抗原或抗体的方法。该技术将血清学的特异性和敏感性与显微技术的精确性结合起 来，解决了生物学上的许多难题，如病毒的侵袭途径及其感染细胞内复制部位的研究，以及抗体的 产生部位等。随着荧光抗体技术的敏感性和特异性的进一步提高，该技术在病原微生物的早期诊 断、肿瘤抗原的研究、抗原抗体免疫组化定位等方面得到了广泛应用。 [目的要求] 1. 掌握荧光抗体染色法诊断猪瘟的基本操作步骤。 2. 了解荧光抗体技术的基本原理。 [材料与试剂] 1. 载玻片，盖玻片，冰冻切片机，荧光显微镜， 2. 0.01mol/L PBS（pH7.2）。 3. 缓冲甘油：优级纯甘油9份和碳酸盐缓冲液1份混合而成。 4. 碳酸盐缓冲液：0.5mol/L 碳酸钠1份与0.5mol/L 碳酸氢钠3份混合。 5. 猪瘟荧光抗体，猪瘟抗血清，病猪的扁桃体或肾脏等。 [操作方法] 1. 切片制备：将冰冻的扁桃体或肾脏进行切片，置载玻片上，空气中自然干燥后，立刻在室 温下放入纯丙酮固定15min。 2. 洗涤：将固定好的切片以PBS轻轻漂洗5次，每次3min。 3. 染色：在晾干的标本片上滴加猪瘟荧光抗体（工作浓度），以覆盖为度，放湿盒内置37℃ 染色30min。 4. 洗涤：取出标本片，以吸管吸PBS冲去玻片中的荧光抗体，然后置大量PBS中漂洗5次，每次 3min，再以蒸馏水冲洗晾干。 5. 封载：染色片半干时，滴加缓冲甘油封片。 本试验需设定以下对照： （1） 阳性对照；含有猪瘟病毒的组织所作的切片； （2） 自发荧光对照，以PBS代替荧光抗体染色； （3） 抑制试验对照，标本上加未标记的猪瘟抗血清，37℃于湿盒内中30min后，PBS漂洗，再 加标记抗体，染色同上。 6. 镜检：将染色后的标本片置荧光显微镜下观察，先用低倍物镜选择适当的标本区，然后换 高倍物镜观察。以油镜观察时，可用缓冲甘油代替香柏油。 7. 结果判定 阳性对照应呈翠绿色荧光，而猪瘟自发荧光对照组和抑制试验对照组应无荧光
阳性结果：扁桃体隐窝上皮细胞或肾曲小管上皮细胞的胞浆内呈明亮的翠绿色荧光，细胞形态 清晰 阴性结果：五荧光或荧光微弱，细胞形态不清晰。 [思考题] 1.荧光抗体染色法的原理是什么？ 2.荧光抗体技术有何优点？ 实验五酶联免疫吸附试验(ELISA) 酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)是目前发展最快，应用最广 泛的一种免疫学检测技术。其基本过程是将抗原或抗体吸附于固相载体上，在载体上进行免疫酶染 色，底物显色后以肉眼或酶标仪检测结果。通过酶与底物作用呈现颜色的深度，进行定量或定性分 析。本试验将抗原抗体反应的特异性与酶的高催化活性相结合，使测定方法达到很高的敏感性，且 特异性强，可用于生物活性物质的微量检测及疾病诊断，广泛应用于整个生命科学领域。 [目的要求] 1.掌握酶联免疫吸附试验的原理及基本操作方法。 2.了解猪群猪瘟抗体监测的意义。 [材料与试剂] 1.酶标板，酶联检测仪（酶标仪），微量加样器，谪头(ti头)。 2.0.01mol/LPBS(pH7.2),0.01mo1/L PBST(含0.01%土温20)，2mo1/LH2S04,pH9.6 碳酸盐缓冲液（包被液），封闭液，邻苯二胺(OPD),3%202,柠檬酸盐缓冲液。 3。猪瘟病毒抗原，兔抗猪1gG酶标抗体，待检血清，猪瘟阳性血清，猪瘟阴性血清。 [实验内容与操作方法] 间接ELISA(以猪瘟抗体的检测为例，该法可用于猪瘟抗体监测) 1.包被：用碳酸盐缓冲液稀释猪瘟病毒抗原至1μg/ml,以微量加样器每孔加样100μL,置湿盒 内37℃包被2-3h。 2.洗涤：以PBST冲洗酶标板，共洗5次，每次3min。 3.加待检血清：每孔加100 uL PBS,然后在酶标板的第1孔加100uL待检血清，以微量加样器反 复吹吸几次混匀，吸100L加至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，剩余的100uL弃去，置湿盒内37℃作 用2h。 4.洗涤：同上。 5.加酶标抗体：以PS将兔抗猪IgG酶标抗体稀释至工作浓度，每孔加100μL,置湿盒内37℃作 用2h
阳性结果：扁桃体隐窝上皮细胞或肾曲小管上皮细胞的胞浆内呈明亮的翠绿色荧光，细胞形态 清晰。 阴性结果：五荧光或荧光微弱，细胞形态不清晰。 [思考题] 1. 荧光抗体染色法的原理是什么? 2. 荧光抗体技术有何优点? 实验五 酶联免疫吸附试验（ELISA） 酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）是目前发展最快，应用最广 泛的一种免疫学检测技术。其基本过程是将抗原或抗体吸附于固相载体上，在载体上进行免疫酶染 色，底物显色后以肉眼或酶标仪检测结果。通过酶与底物作用呈现颜色的深度，进行定量或定性分 析。本试验将抗原抗体反应的特异性与酶的高催化活性相结合，使测定方法达到很高的敏感性，且 特异性强，可用于生物活性物质的微量检测及疾病诊断，广泛应用于整个生命科学领域。 [目的要求] 1. 掌握酶联免疫吸附试验的原理及基本操作方法。 2. 了解猪群猪瘟抗体监测的意义。 [材料与试剂] 1. 酶标板，酶联检测仪（酶标仪），微量加样器，滴头（tip头）。 2. 0.01mol/L PBS（pH7.2）， 0.01mol/L PBST（含0.01%土温20）， 2mol/L H2SO4，pH9.6 碳酸盐缓冲液（包被液），封闭液，邻苯二胺（OPD），3% H2O2，柠檬酸盐缓冲液。 3. 猪瘟病毒抗原，兔抗猪IgG酶标抗体，待检血清，猪瘟阳性血清，猪瘟阴性血清。 [实验内容与操作方法] 间接ELISA（以猪瘟抗体的检测为例，该法可用于猪瘟抗体监测） 1. 包被：用碳酸盐缓冲液稀释猪瘟病毒抗原至1mg/ml，以微量加样器每孔加样100mL，置湿盒 内37℃包被2-3h。 2. 洗涤：以PBST冲洗酶标板，共洗5次，每次3min。 3. 加待检血清：每孔加100mL PBS，然后在酶标板的第1孔加100mL待检血清，以微量加样器反 复吹吸几次混匀，吸100mL加至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，剩余的100mL弃去，置湿盒内37℃作 用2h。 4. 洗涤：同上。 5. 加酶标抗体：以PBS将兔抗猪IgG酶标抗体稀释至工作浓度，每孔加100mL，置湿盒内37℃作 用2h