急性淋巴细胞白血病药物刎临床试验中检测微小残留病的技术指导原则（2020年8月）

急性淋巴细胞白血病药物刎临床试验中 检测微小残留病的技术指导原则 2020年8月

1 2020 年 8 月

目录 一、概述.... 3 二、ALL的MRD检测... 5 (一)MRD检测的方法选择 。。。 5 (二)MRD检测的方法学要求 ……… 6 1.细胞学检测方法.... 6 2.分子学检测方法... 7 3.样本... 三、ALL新药研发中的MRD应用.... 8 (一)临界值的选择... 8 (二)早期探索性临床研究中的应用.· 8 (三)关键性注册临床研究中的应用....·.· 9 1.人群选择.. 9 2.人群富集.... 9 3.疗效终点... 9 4.检测时间点或时间窗..... 11 5.对临床研究开展和执行的其他要求...... 12 四、总结.· 12 五、参考文献 13 2

2 一、概述......................................... 3 二、ALL 的 MRD 检测 ............................... 5 （一）MRD 检测的方法选择 ......................... 5 （二）MRD 检测的方法学要求 ....................... 6 1.细胞学检测方法............................ 6 2.分子学检测方法............................ 7 3.样本 ..................................... 7 三、ALL 新药研发中的 MRD 应用...................... 8 （一）临界值的选择............................... 8 （二）早期探索性临床研究中的应用 ................. 8 （三）关键性注册临床研究中的应用 ................. 9 1.人群选择.................................. 9 2.人群富集.................................. 9 3.疗效终点.................................. 9 4.检测时间点或时间窗....................... 11 5.对临床研究开展和执行的其他要求 ........... 12 四、总结........................................ 12 五、参考文献.................................... 13

一、概述 急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia, ALL)是常见的血液系统恶性肿瘤。随着联合化疗方案的不 断优化和医疗条件的整体改善，新诊断的ALL患者完全缓 解(Complete remission,.CR)率可达到70%~95%，被认为是 一种可治愈性恶性疾病。传统的治疗反应判断基于形态学检 测，骨髓原始细胞比例<5%，外周血无原始细胞可被判断为 形态学C,这种方法检测骨髓中白血病细胞的敏感性通常 在l02。采用敏感性更高的多参数流式细胞术(Multiparameter flow cytometry,MFC)或定量聚合酶链式反应(Quantitative polymerase chain reaction,.qPCR)进行检测，发现获得形态 学CR的患者中30%50%的患者白血病细胞持续存在。这些 在形态学CR患者中仍然可以被检测到的白血病细胞即被称 为微小残留病(Minimal residual disease,MRD),也被称为 可检测残留病(Measurable residual disease)。在ALL的治疗 过程中对MRD进行有计划的监测，其临床价值已有共识。 MRD状态可以反映治疗后的肿瘤细胞对化疗药物的敏感程 度和白血病细胞负荷，也可以成为复发风险的预测因子，是 决定患者的危险分层、预后判断、后续治疗选择的关键因素 之一，也因此成为临床治疗中进行疾病监测的良好指标。 虽然对ALL患者进行MRD检测已经成为临床实践中的 常规手段，但在新药研发临床试验中合理应用MRD却依然

3 一、概述 急性淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia， ALL）是常见的血液系统恶性肿瘤。随着联合化疗方案的不 断优化和医疗条件的整体改善，新诊断的 ALL 患者完全缓 解（Complete remission, CR）率可达到 70%~95%，被认为是 一种可治愈性恶性疾病。传统的治疗反应判断基于形态学检 测，骨髓原始细胞比例<5%，外周血无原始细胞可被判断为 形态学 CR，这种方法检测骨髓中白血病细胞的敏感性通常 在 10-2。采用敏感性更高的多参数流式细胞术（Multiparameter flow cytometry，MFC）或定量聚合酶链式反应（Quantitative polymerase chain reaction，qPCR）进行检测，发现获得形态 学 CR 的患者中 30%~50%的患者白血病细胞持续存在。这些 在形态学 CR 患者中仍然可以被检测到的白血病细胞即被称 为微小残留病（Minimal residual disease，MRD），也被称为 可检测残留病（Measurable residual disease）。在 ALL 的治疗 过程中对 MRD 进行有计划的监测，其临床价值已有共识。 MRD 状态可以反映治疗后的肿瘤细胞对化疗药物的敏感程 度和白血病细胞负荷，也可以成为复发风险的预测因子，是 决定患者的危险分层、预后判断、后续治疗选择的关键因素 之一，也因此成为临床治疗中进行疾病监测的良好指标。 虽然对 ALL患者进行 MRD检测已经成为临床实践中的 常规手段，但在新药研发临床试验中合理应用 MRD 却依然

面临诸多挑战。首先，MRD检测的方法学并不统一，各临床 单位和实验室的操作流程存在差异，对检测结果的解读可能 受操作人员技术水平的影响。其次，MRD阳性/阴性的判断 界值也未获得完全共识，不同临床试验对标本的要求和标本 采集的时间也并不完全一致。此外，国内尚无技术要求或行 业标准对临床试验中进行MRD检测的方法、界值、数据/信 息采集计划提出要求，或对MRD检测用于新药注册的实际 价值予以明确。这些因素都直接影响ALL新药临床研发的 推进和对临床研究结果的理解。 本技术指导原则针对在我国研发的ALL新药，对临床 研究尤其关键性注册临床研究中进行MRD检测提出观点和 建议，适用于在成人和儿童ALL人群中开展的临床研究，供 药物研发的申请人和研究者参考。有关ALL新药临床研究 计划和具体设计、MRD检测的方法学细节、伴随诊断研发的 具体要求等内容，未被涵盖于本技术指导原则的范畴。本文 所指的急性淋巴细胞白血病不包括成熟B细胞白血病/淋巴 瘤。 应用本技术指导原则时，还请同时参考国际人用药品注 册技术协调会(The International Conference for Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,ICH)和其他国内外已发布的相关技术指导 原则

4 面临诸多挑战。首先，MRD 检测的方法学并不统一，各临床 单位和实验室的操作流程存在差异，对检测结果的解读可能 受操作人员技术水平的影响。其次，MRD 阳性/阴性的判断 界值也未获得完全共识，不同临床试验对标本的要求和标本 采集的时间也并不完全一致。此外，国内尚无技术要求或行 业标准对临床试验中进行 MRD 检测的方法、界值、数据/信 息采集计划提出要求，或对 MRD 检测用于新药注册的实际 价值予以明确。这些因素都直接影响 ALL 新药临床研发的 推进和对临床研究结果的理解。 本技术指导原则针对在我国研发的 ALL 新药，对临床 研究尤其关键性注册临床研究中进行 MRD 检测提出观点和 建议，适用于在成人和儿童 ALL 人群中开展的临床研究，供 药物研发的申请人和研究者参考。有关 ALL 新药临床研究 计划和具体设计、MRD 检测的方法学细节、伴随诊断研发的 具体要求等内容，未被涵盖于本技术指导原则的范畴。本文 所指的急性淋巴细胞白血病不包括成熟 B 细胞白血病/淋巴 瘤。 应用本技术指导原则时，还请同时参考国际人用药品注 册技术协调会（The International Conference for Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH）和其他国内外已发布的相关技术指导 原则

二、ALL的MRD检测 (一)MRD检测的方法选择 临床上用于检测ALL MRD水平的常用方法包括多参数 流式细胞术(MFC)和定量聚合酶链式反应(qPCR)。近年 来，针对免疫球蛋白T细胞受体基因重排(IG/TR)的二代 DNA测序技术(Next generation sequencing,NGS)在临床中 的应用日益广泛。在中国，MFC(目前多为4~6色)是应用 最广泛的ALL MRD检测手段，技术相对成熟，多数三级甲 等医院都具备MFC检测能力，但各实验室所采用的仪器、 操作流程和对结果的分析解读能力存在差异。具有特定融合 基因（如BCR-ABL1)的ALL通常选择逆转录(Reverse transcript)qPCR进行MRD检测，结果一致性较高。NGS在 国内的应用时间短，通常由第三方检测机构完成，各实验室 之间并没有统一的操作标准，无法保证结果的一致性。 表1对微小残留病检测方法的评价 方法 优势 局限性 敏感性 多参数流式细胞术 ◇快速 令缺少统一标准 104(0.01%) √基线和缓解时白令可定量抗原表达令对操作人员的专业 血病相关免疫表 水平 性要求高 型比较法 DN法不需要获令需要新鲜活细胞 √不同于正常细胞 得治疗前标本令发生免疫表型转化 表型法(DN法) 时有假阴性风险 可能不能将恶性淋 巴母细胞从正常的 造血祖细胞中区分 出来 针对免疫球蛋白T细女：相对统一的操作令耗时耗力 104103 胞受体重排的等位基 和解读标准 需要治疗前标本 (0.01-0.001%) 因特异性PCR(ASO 前体T细胞ALL结

5 二、ALL 的 MRD 检测 （一）MRD 检测的方法选择 临床上用于检测 ALL MRD 水平的常用方法包括多参数 流式细胞术（MFC）和定量聚合酶链式反应（qPCR）。近年 来，针对免疫球蛋白/T 细胞受体基因重排（IG/TR）的二代 DNA 测序技术（Next generation sequencing，NGS）在临床中 的应用日益广泛。在中国，MFC（目前多为 4~6 色）是应用 最广泛的 ALL MRD 检测手段，技术相对成熟，多数三级甲 等医院都具备 MFC 检测能力，但各实验室所采用的仪器、 操作流程和对结果的分析解读能力存在差异。具有特定融合 基因（如 BCR-ABL1）的 ALL 通常选择逆转录（Reverse transcript）qPCR 进行 MRD 检测，结果一致性较高。NGS 在 国内的应用时间短，通常由第三方检测机构完成，各实验室 之间并没有统一的操作标准，无法保证结果的一致性。 表 1 对微小残留病检测方法的评价 方法 优势 局限性 敏感性 多参数流式细胞术  基线和缓解时白 血病相关免疫表 型比较法  不同于正常细胞 表型法（DfN 法）  快速  可定量抗原表达 水平  DfN 法不需要获 得治疗前标本  缺少统一标准  对操作人员的专业 性要求高  需要新鲜活细胞  发生免疫表型转化 时有假阴性风险  可能不能将恶性淋 巴母细胞从正常的 造血祖细胞中区分 出来 10-4（0.01%） 针对免疫球蛋白/T 细 胞受体重排的等位基 因特异性 PCR（ASO-  相对统一的操作 和解读标准  耗时耗力  需要治疗前标本  前体 T 细胞 ALL 结 10-4~10-5 （0.01~0.001%）

PCR) 果准确性欠佳 针对特有融合基因的◇操作简单 只适用于不到50%105(0.001%) 定量PCR 的ALL患者 针对免疫球蛋白T细令敏感性高 令缺少统一标准 10-6(0.0001%) 胞受体重排的NGS 高效 ◇需要治疗前标本 可同时检测多种 临床数据有限，检测 克隆并追踪克隆 结果的临床意义未 演变 得到充分验证 ALL,急性淋巴细胞白血病；NGS,二代基因测序；PCR,聚合酶链式反应 对上述细胞学(MFC)和分子学(qPCR、NGS)方法当 前在临床应用中的优势和局限性总结见表1，可见这些方法 用于ALL MRD检测各有优劣，监管机构并不对临床试验中 的检测方法行特别规定。申请人应该根据目标人群选用适用 性强、敏感性和特异性高、可重复性良好、且有充分的数据 证明其检测结果临床意义的检测方法，方法的敏感性应不高 于MRD临界值的1/10（若临界值为0.01%/104时，敏感性 ≤0.001%/105)。在某一项临床试验中，应该采用统一的方法 对所有受试者进行MRD检测，并在研究方案中预先明确。 如果计划在一项临床研究中同时采用多种方法进行MRD检 测，应该提前说明以哪种方法的检测结果进行主要分析。 (二)MRD检测的方法学要求 针对具体的检测方法，在临床试验方案的制定过程中应 针对该检测方法的特征和局限性拟定标准或解决方案。 1.细胞学检测方法 申请人如果计划在临床试验中采用细胞学方法即MF℃进 行MRD检测，至少应该说明或考虑以下问题： 6

6 PCR） 果准确性欠佳 针对特有融合基因的 定量 PCR  操作简单  只适用于不到 50% 的 ALL 患者 10-5（0.001%） 针对免疫球蛋白/T 细 胞受体重排的 NGS  敏感性高  高效  可同时检测多种 克隆并追踪克隆 演变  缺少统一标准  需要治疗前标本  临床数据有限，检测 结果的临床意义未 得到充分验证 10-6（0.0001%） ALL，急性淋巴细胞白血病；NGS，二代基因测序；PCR，聚合酶链式反应。 对上述细胞学（MFC）和分子学（qPCR、NGS）方法当 前在临床应用中的优势和局限性总结见表 1，可见这些方法 用于 ALL MRD 检测各有优劣，监管机构并不对临床试验中 的检测方法行特别规定。申请人应该根据目标人群选用适用 性强、敏感性和特异性高、可重复性良好、且有充分的数据 证明其检测结果临床意义的检测方法，方法的敏感性应不高 于 MRD 临界值的 1/10（若临界值为 0.01%/10-4 时，敏感性 ≤0.001%/10-5）。在某一项临床试验中，应该采用统一的方法 对所有受试者进行 MRD 检测，并在研究方案中预先明确。 如果计划在一项临床研究中同时采用多种方法进行 MRD 检 测，应该提前说明以哪种方法的检测结果进行主要分析。 （二）MRD 检测的方法学要求 针对具体的检测方法，在临床试验方案的制定过程中应 针对该检测方法的特征和局限性拟定标准或解决方案。 1.细胞学检测方法 申请人如果计划在临床试验中采用细胞学方法即 MFC 进 行 MRD 检测，至少应该说明或考虑以下问题：

。预先规定标本采集时需要获得的细胞数下限。 。预先考虑可能影响样本及细胞稳定性的因素（例如标 本稀释、运输耗时过长、保存条件等)，提出预防措施 和/或解决方案。 ·使用一致的抗体和荧光组合、分析模板（如设门策略）。 。提前分析治疗是否会影响某一抗原的可检测性。 ●评估化疗后正常的骨髓细胞被误读为肿瘤细胞的可能 性。 2.分子学检测方法 申请人如果计划在临床试验中采用分子学方法进行MRD 检测，至少应该说明或考虑以下问题： ●提出针对核酸质量和数量的要求。 ·通过计算核酸含量获得细胞数量时，应该考虑设立内 部对照，以避免因核酸质量问题导致的假阴性。 ●明确是否需要获得/保存诊断时的样本，用于确定克隆 型。 ●关注因克隆型转变、改变分析方法或其他原因导致的 检测失败，对相关情形进行跟踪总结，并分析检测失败 率对终点计算的影响。 3.样本 对于ALL患者MRD状态的检测和监测，最佳的检测样本 为骨髓，并且建议采用骨髓穿刺成功后第一次抽吸或最初抽 >

7  预先规定标本采集时需要获得的细胞数下限。  预先考虑可能影响样本及细胞稳定性的因素（例如标 本稀释、运输耗时过长、保存条件等），提出预防措施 和/或解决方案。  使用一致的抗体和荧光组合、分析模板（如设门策略）。  提前分析治疗是否会影响某一抗原的可检测性。  评估化疗后正常的骨髓细胞被误读为肿瘤细胞的可能 性。 2.分子学检测方法 申请人如果计划在临床试验中采用分子学方法进行 MRD 检测，至少应该说明或考虑以下问题：  提出针对核酸质量和数量的要求。  通过计算核酸含量获得细胞数量时，应该考虑设立内 部对照，以避免因核酸质量问题导致的假阴性。  明确是否需要获得/保存诊断时的样本，用于确定克隆 型。  关注因克隆型转变、改变分析方法或其他原因导致的 检测失败，对相关情形进行跟踪总结，并分析检测失败 率对终点计算的影响。 3.样本 对于 ALL 患者 MRD 状态的检测和监测，最佳的检测样本 为骨髓，并且建议采用骨髓穿刺成功后第一次抽吸或最初抽

吸获得的标本。如果计划采用外周血作为分析样本，应该说 明理由并提供依据。 三、ALL新药研发中的MRD应用 （一)临界值的选择 在ALL新药的临床试验中所选择的MRD临界值取决于 使用MRD的目的。现阶段，MRD阴性（或不可测）意味着 骨髓中每10000个有核细胞中的白血病细胞少于1个（即 MRD水平<104)。MRD反应则被定义为：采用足够敏感的 检测方法，骨髓MRD水平降低至104以下。采用MRD水 平作为人群复发风险预测指标时，达到首次或二次C℉但 MRD水平持续≥0.1%(103)被认为具有更高的复发风险。 随着检测技术的发展和治疗手段的更新，具体的MRD临界 值可能会发生变化。申请人应该为具体的MRD水平界值提 供依据。 (二)早期探索性临床研究中的应用 考虑到MRD对于ALL患者的诊疗具有非常重要的临床 价值，强烈建议申请人在早期探索性临床研究中即对受试者 进行MRD状态的监测；如果研究对象为既往接受过治疗的 患者，建议充分收集受试者既往治疗过程中的MRD相关信 息。监测的方法和流程应该符合临床实践中形成的共识。早 期探索性临床试验中获得的MRD相关数据可以为推荐剂量、 目标人群的选择提供依据，也可用于分析MRD状态与临床

8 吸获得的标本。如果计划采用外周血作为分析样本，应该说 明理由并提供依据。 三、ALL 新药研发中的 MRD 应用 （一）临界值的选择 在 ALL新药的临床试验中所选择的 MRD临界值取决于 使用 MRD 的目的。现阶段，MRD 阴性（或不可测）意味着 骨髓中每 10000 个有核细胞中的白血病细胞少于 1 个（即 MRD 水平<10-4）。MRD 反应则被定义为：采用足够敏感的 检测方法，骨髓 MRD 水平降低至 10-4 以下。采用 MRD 水 平作为人群复发风险预测指标时，达到首次或二次 CR 但 MRD 水平持续≥0.1%（10-3）被认为具有更高的复发风险。 随着检测技术的发展和治疗手段的更新，具体的 MRD 临界 值可能会发生变化。申请人应该为具体的 MRD 水平界值提 供依据。 （二）早期探索性临床研究中的应用 考虑到 MRD对于 ALL患者的诊疗具有非常重要的临床 价值，强烈建议申请人在早期探索性临床研究中即对受试者 进行 MRD 状态的监测；如果研究对象为既往接受过治疗的 患者，建议充分收集受试者既往治疗过程中的 MRD 相关信 息。监测的方法和流程应该符合临床实践中形成的共识。早 期探索性临床试验中获得的 MRD 相关数据可以为推荐剂量、 目标人群的选择提供依据，也可用于分析 MRD 状态与临床

终点之间的相关性。 (三)关键性注册临床研究中的应用 对于ALL新药关键性注册临床研究，MRD信息的收集 和MRD状态的监测在人群的选择和富集、疗效判断和疾病 监测的过程中有重要价值。 1.人群选择 MRD状态是独立的ALL复发风险因子，申请人应该考 虑将MRD作为临床试验中的随机分层因素、筛选高风险人 群的指标或亚组分析的生物标记物。例如，在以复发难治性 ALL为目标人群的临床试验中，可收集患者既往治疗/末次 治疗缓解状态中的MRD水平，作为随机分层的因素；以新 诊断患者为目标人群时，以是否实现MRD阴性或MRD水 平对其他有效性指标进行亚组分析。 2.人群富集 MRD状态也可以成为ALL临床研究中富集人群的指标。 例如以治疗后已获得血液学C℉的患者（计划维持治疗/移植） 作为目标人群时，采用（某一治疗节点的）MRD水平作为富 集人群的生物标记物，将既往治疗史不同的ALL患者纳入 同一研究以扩大潜在受试人群。 3.疗效终点 现阶段，以首次或二次治疗达到血液学CR但是MRD 水平持续≥0.1%的前体B细胞ALL患者作为目标人群时

9 终点之间的相关性。 （三）关键性注册临床研究中的应用 对于 ALL 新药关键性注册临床研究，MRD 信息的收集 和 MRD 状态的监测在人群的选择和富集、疗效判断和疾病 监测的过程中有重要价值。 1.人群选择 MRD 状态是独立的 ALL 复发风险因子，申请人应该考 虑将 MRD 作为临床试验中的随机分层因素、筛选高风险人 群的指标或亚组分析的生物标记物。例如，在以复发难治性 ALL 为目标人群的临床试验中，可收集患者既往治疗/末次 治疗缓解状态中的 MRD 水平，作为随机分层的因素；以新 诊断患者为目标人群时，以是否实现 MRD 阴性或 MRD 水 平对其他有效性指标进行亚组分析。 2.人群富集 MRD 状态也可以成为 ALL 临床研究中富集人群的指标。 例如以治疗后已获得血液学 CR的患者（计划维持治疗/移植） 作为目标人群时，采用（某一治疗节点的）MRD 水平作为富 集人群的生物标记物，将既往治疗史不同的 ALL 患者纳入 同一研究以扩大潜在受试人群。 3.疗效终点 现阶段，以首次或二次治疗达到血液学 CR 但是 MRD 水平持续≥0.1%的前体 B 细胞 ALL 患者作为目标人群时

接受MRD反应率作为替代终点的临床研究设计。由于MRD 反应率并非临床终点，其结果的可靠性受检测手段的影响， 与总体生存时间(Overall survival,OS)、无复发生存时间 (Relapse free survival,RFS入、无进展生存时间(Progression free survival,PFS)和无疾病生存时间(Disease free survival, DFS)等临床终点的相关性强度，可能因人群、治疗环境和 药物机制的不同而发生变化，以该替代终点获批上市通常为 附条件批准，并需要结合反应持续时间和/或是否因治疗带来 其他临床获益综合考量。若关键性注册研究为随机对照设计， 申请人应该通过在同一研究继续治疗随访，明确基于OS、 RFS、P℉S和/或DFS等临床终点的治疗获益；若为单臂研究 设计，申请人应该在相关人群中开展其他随机对照研究，以 临床终点作为主要疗效终点开展确证性临床研究。 在以其他疗效指标作为主要疗效终点时，MRD反应率 也应该是重要的次要疗效终点。针对复发难治ALL患者的 新药，如果可以获得持久的CR,MRD反应率是治疗疗效的 有力支持。所有ALL适应症关键性注册研究，均应该对治疗 后的MRD反应率进行评价。 对MRD反应率进行计算时，可用达到血液学CR的所 有受试者作为分析人群，也可用所有接受治疗的受试者作为 分析人群，取决于临床试验所纳入的受试人群和计算反应率 所针对的具体问题。作为疗效终点时，应该基于意向治疗 10

10 接受 MRD 反应率作为替代终点的临床研究设计。由于 MRD 反应率并非临床终点，其结果的可靠性受检测手段的影响， 与总体生存时间（Overall survival，OS）、无复发生存时间 （Relapse free survival，RFS）、无进展生存时间（Progression free survival，PFS）和无疾病生存时间（Disease free survival， DFS）等临床终点的相关性强度，可能因人群、治疗环境和 药物机制的不同而发生变化，以该替代终点获批上市通常为 附条件批准，并需要结合反应持续时间和/或是否因治疗带来 其他临床获益综合考量。若关键性注册研究为随机对照设计， 申请人应该通过在同一研究继续治疗随访，明确基于 OS、 RFS、PFS 和/或 DFS 等临床终点的治疗获益；若为单臂研究 设计，申请人应该在相关人群中开展其他随机对照研究，以 临床终点作为主要疗效终点开展确证性临床研究。 在以其他疗效指标作为主要疗效终点时，MRD 反应率 也应该是重要的次要疗效终点。针对复发难治 ALL 患者的 新药，如果可以获得持久的 CR，MRD 反应率是治疗疗效的 有力支持。所有 ALL 适应症关键性注册研究，均应该对治疗 后的 MRD 反应率进行评价。 对 MRD 反应率进行计算时，可用达到血液学 CR 的所 有受试者作为分析人群，也可用所有接受治疗的受试者作为 分析人群，取决于临床试验所纳入的受试人群和计算反应率 所针对的具体问题。作为疗效终点时，应该基于意向治疗