山东翟工大雾实验2革兰氏染色法KOH法鉴别革兰氏阴性菌和阳性菌山东理工大学生命科学学院微生物学教研组2019.02
实验2 革兰氏染色法 KOH法鉴别革兰氏阴性菌和阳性菌 山东理工大学生命科学学院 微生物学教研组 2019. 02 1
山东理工大提纲1.实验目的2.实验原理3.实验材料4.实验步骤5.注意事项
提纲 2 1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验材料 4. 实验步骤 5. 注意事项
山东理工大雾1、实验目的学习并掌握细菌的革兰氏染色法及其原理；了解KOH法快速鉴别革兰氏阴性菌和阳性菌：巩固显微镜油镜操作技术及无菌操作技术
1、实验目的 3 • 学习并掌握细菌的革兰氏染色法及其原理； • 了解KOH法快速鉴别革兰氏阴性菌和阳性菌； • 巩固显微镜油镜操作技术及无菌操作技术
山东理工大客2、实验原理什么是革兰氏染色法？细菌经过初染-媒染-脱色-复染紫红如果细菌细胞不被脱色而保留初染紫颜色者，称为革兰氏阳性菌（G+）若被脱色，而染上复染剂的红颜色者，称为革兰氏阴性菌（G-）。问题：为什么两类细菌染色结果不同？
2、实验原理 4 什么是革兰氏染色法？ ◆细菌经过 初染-媒染-脱色-复染 紫 红 ◆如果细菌细胞不被脱色而保留初染紫颜色者， 称为革兰氏阳性菌（G+）， ◆若被脱色，而染上复染剂的红颜色者，称为革 兰氏阴性菌（G－）。 ◆问题：为什么两类细菌染色结果不同？
山东理工大雾2、实验原理革兰氏染色反应的机制：细胞壁结构和组成的差异细胞壁厚，肽聚糖含量高、层次多、交联紧密，无类脂aG+细菌：脱色时失水网孔缩小，初染的结晶紫碘复合物留在壁内（紫色），复染后呈紫红色。b）G细菌：细胞壁薄、肽聚糖含量低、层次少、交联蔬松，有类脂外膜脱色时类脂外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖层不能阻挡结晶紫-碘复合物的溶出，脱色后退为无色，复染后呈现红色
2、实验原理 革兰氏染色反应的机制： 细胞壁结构和组成的差异 a) G+细菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高、层次多、交联紧密，无类脂 脱色时失水网孔缩小，初染的结晶紫-碘复合物留在壁内（紫色），复染后呈紫 红色。 b）G-细菌：细胞壁薄、肽聚糖含量低、层次少、交联疏松，有类脂外膜 脱色时类脂外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖层不能阻挡结晶紫-碘复合物的溶 出，脱色后退为无色，复染后呈现红色
山东理工大家2、实验原理KOH法快速鉴别革兰氏阴性菌和阳性菌原理：细胞壁结构和组成的差异a）G细菌：细胞壁薄、肽聚糖含量少，脂多糖含量高，遇KOH溶液时，细胞裂解释放出DNA。DNA和蛋白质、脂多糖复合物遇KOH形成粘稠的胶冻状物，可以拉出粘丝状。b）G+细菌：细胞壁厚、肽聚糖含量多、无类脂，细胞壁坚固，遇KOH溶液无反应
2、实验原理 KOH法快速鉴别革兰氏阴性菌和阳性菌原理: 细胞壁结构和组成的差异 a） G- 细菌：细胞壁薄、肽聚糖含量少，脂多糖含量高，遇KOH溶液时，细胞裂解释放 出DNA。DNA和蛋白质、脂多糖复合物遇KOH形成粘稠的胶冻状物，可以拉出粘丝状。 b ） G+细菌：细胞壁厚、肽聚糖含量多、无类脂，细胞壁坚固，遇KOH溶液无反应
山东理工大雾3、实验材料》材料大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌培养16-24h的菌液，斜面或固体平板。》试剂革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液、番红等），香柏油（或液体石蜡），二甲苯（或乙醚：乙醇=7:3），无菌水30g/LKOH;器具显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯
3、实验材料 7 ➢ 材料 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌培养16-24 h的菌液, 斜面 或固体平板。 ➢ 试剂 革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液、 番红等），香柏油（或液体石蜡），二甲苯（或乙醚：乙醇=7:3），无菌水、 30 g/L KOH； ➢ 器具 显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯
山东理工大雾4、实验步骤-革兰氏染色·1制片（涂片、干燥、固定）·2初染（水洗）1-2min结晶紫（水洗）·3媒染1min碘液·4脱色20-30S乙醇（水洗）·5复染2min番红（水洗干燥）·6镜检油镜
4、实验步骤-革兰氏染色 8 • 1 制片 （涂片、干燥、 固定） • 2 初染 1-2 min 结晶紫 （水洗） • 3 媒染 1 min碘液 （水洗） • 4 脱色 20-30 S 乙醇 （水洗） • 5 复染 2 min番红 （水洗 干燥） • 6 镜检 油镜
山东理工大雾4、实验步骤-革兰氏染色制片（参考实验书P38）·涂片固定·干燥涂片固定·杀死细菌，固定细胞形态。·使菌体粘附于坡片上。·增加细菌对染料的亲和力。常用的方法有酒精灯火焰加热和化学固定二种
4、实验步骤-革兰氏染色 9 制片（参考实验书P38） • 涂片 • 干燥 • 固定 • 杀死细菌，固定细胞形态。 • 使菌体粘附于坡片上。 • 增加细菌对染料的亲和力。 常用的方法有酒精灯火焰加热和化学固定二种
山东理工大家4、实验步骤-革兰氏染色革兰氏染色固定初染水洗染色步骤：涂片初染1-2min结晶紫媒染1-2min碘液脱色20-30S乙醇媒染脱色水洗水洗复染复红2-3min紫红色染色结果：G+细菌干燥复染水洗镜检红色G细菌注意初染、媒染、脱色及复染后都需要水洗。复染水洗后需要干燥才可以镜检（吸水纸吸干、自然晾干或冷风吹干）
4、实验步骤-革兰氏染色 10 革兰氏染色 染色步骤： 初染 1-2min 结晶紫 媒染 1-2min碘液 脱色 20-30S乙醇 复染 复红 2-3min 染色结果： G+细菌 紫红色 G- 细菌 红色 注意初染、媒染、脱色及复染后都需要水洗。复染水洗后需要干燥才可以镜检（吸水纸吸干、自然晾干或冷风 吹干）