实验八化学因素和生物因素对微生物生长的影响
实验八 化学因素和生物因素对微生物生长的影响
1.实验目的1）了解抗生素对微生物生长的影响，学习药敏试验的基本方法一药敏纸片琼脂扩散法。2）了解化学消毒剂对微生物生长的影响，学习醇类消毒剂抑菌实验方法。3）了解有毒重金属对微生物生长的影响，学习最小抑菌浓度（MIC）测定方法
1）了解抗生素对微生物生长的影响，学习药敏试验的基本 方法—药敏纸片琼脂扩散法。 2）了解化学消毒剂对微生物生长的影响，学习醇类消毒剂 抑菌实验方法。 3）了解有毒重金属对微生物生长的影响，学习最小抑菌浓 度（MIC）测定方法。 1. 实验目的
2.实验原理1）抗生素药敏试验（生物因素）抗生素是一类由微生物或其它生物生命活动中合成的次级代谢产物或其人工衍生物，在低浓度时就能抑制或于扰它种生物的生命活动，可作为优良的化学治疗剂，不同微生物对不同抗生素的敏感度不同。针对细胞壁结构针对细胞膜功能杆菌肽和结构：β内酰胺类黏菌素类磷德素多黏菌素8粮明太类抗生素抑菌机制细胞修THF针对叶酸细菌合成：蛋白质DHF细胞膜甲氧芋啶磺胺类DNARNAPABAPABA-针对DNA结构利福平针对蛋白质合成：对氨基苯甲酸和功能：氨基糖式类DHF=唯诺酮类林可胺类二氮叶酸呋哺安因大环内酯类THF-四氯叶酸四环素类硝基咪唑
• 抗生素是一类由微生物或其它生物生命活动中合成的次级 代谢产物或其人工衍生物，在低浓度时就能抑制或干扰它 种生物的生命活动，可作为优良的化学治疗剂，不同微生 物对不同抗生素的敏感度不同。 2. 实验原理 1）抗生素药敏试验（生物因素） 抗 生 素 抑 菌 机 制
1）抗生素药敏试验（生物因素）·药敏实验常用方法包含纸片扩散法，稀释法（包括琼脂和肉汤稀释法），抗生素浓度梯度法和自动化仪器等。·纸片扩散法（Kirby-BauerDiskDiffusion）是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，药物的浓度逐渐减少，从而在纸片周围形成浓度梯度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，而抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关
• 药敏实验常用方法包含纸片扩散法，稀释法（包括琼脂和肉汤稀释法）， 抗生素浓度梯度法和自动化仪器等。 • 纸片扩散法（Kirby-Bauer Disk Diffusion）是将含有定量抗菌药物的滤纸 片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随 着扩散距离的增加，药物的浓度逐渐减少，从而在纸片周围形成浓度梯 度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，而抑菌范围外的 菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药 物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈 的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC 呈负相关。 1）抗生素药敏试验（生物因素）
2）乙醇抑菌试验（化学因素：化学消毒剂是指用化学消毒药物作用于微生物和病原体，使其蛋白质变性，失去正常功能而死亡。自前常用的有醇类消毒剂、氧化消毒剂、含氯消毒剂、碘类消毒剂、醛类消毒剂、杂环类气体消毒剂、酚类消毒剂、季胺类消毒剂等。·醇类消毒剂：杀菌机理是使蛋白变性，干扰代谢；杀菌特点是对细菌有效，对芽孢、真菌、病毒无效，如乙醇、乙丙醇等。该类消毒剂为中效消毒剂，只能用于一般性消毒
2）乙醇抑菌试验（化学因素） • 化学消毒剂是指用化学消毒药物作用于微生物和病原体，使 其蛋白质变性，失去正常功能而死亡。目前常用的有醇类消 毒剂、氧化消毒剂、含氯消毒剂、碘类消毒剂、醛类消毒剂、 杂环类气体消毒剂、酚类消毒剂、季胺类消毒剂等。 • 醇类消毒剂：杀菌机理是使蛋白变性,干扰代谢；杀菌特点是 对细菌有效,对芽孢、真菌、病毒无效，如乙醇、乙丙醇等。 该类消毒剂为中效消毒剂，只能用于一般性消毒
3）铬酸钾抑菌试验（化学因素）大多数金属离子都具备抗菌能力，对大部分的细菌真菌都有一定的抑制、杀灭的作用。当微生物与金属离子接触后，由于金属毒性，使微生物蛋白质结构破坏，微生物体内生化过程受阻、代谢紊乱，造成微生物死亡，例如铬酸钾中的铬离子。金属离子抑菌能力常用最小抑菌浓度（MIC）来表征，MIC：在与微生物生长速率有关的特定时间间隔内，通常是18一24小时，能够抑制被测菌生长的最低药物浓度
3）铬酸钾抑菌试验（化学因素） MIC：在与微生物生长速率有关的特定时间间隔内，通常是 18－24小时，能够抑制被测菌生长的最低药物浓度。 大多数金属离子都具备抗菌能力，对大部分的细菌真菌都有一 定的抑制、杀灭的作用。当微生物与金属离子接触后，由于金 属毒性，使微生物蛋白质结构破坏，微生物体内生化过程受阻、 代谢紊乱，造成微生物死亡，例如铬酸钾中的铬离子。 金属离子抑菌能力常用最小抑菌浓度（MIC）来表征
3.实验材料·菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌悬液·培养基：Mueller-HintonBroth&Agar（MHB&MHA）·供试抗生素：氨芊青霉素、头孢氨苄、卡那霉素、氯霉素、四环素药敏纸片，95%-75%-55%-35%医用酒精，1M&100mM铬酸钾母液（K,CrO4，有毒，戴PE手套操作，避免接触皮肤），无菌生理盐水等。设备与用具：恒温培养箱、摇床、接种环、移液枪、培养血、玻璃试管、PA瓶、涂布棒、吸水纸、PE手套、打孔器等
•菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌悬液 •培养基：Mueller-Hinton Broth & Agar（MHB&MHA） •供试抗生素：氨苄青霉素、头孢氨苄、卡那霉素、氯霉素、四 环素药敏纸片，95%-75%-55%-35%医用酒精，1 M&100 mM 铬酸钾母液（K2CrO4，有毒，戴PE手套操作，避免接触皮 肤）， 无菌生理盐水等。 •设备与用具：恒温培养箱、摇床、接种环、移液枪、培养皿、 玻璃试管、PA瓶、涂布棒、吸水纸、PE手套、打孔器等。 3. 实验材料
4.实验方法1）抗生素药敏试验倒MHA平板（每个平板约倒25mL左右，倒2个平板）；可取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌涂布棒将待检细菌混悬液涂布于平血培养基表面。要求涂布均匀致密，直接悬液法要把菌液浓度用无菌生理盐水或PBS缓冲液调到0.5个麦氏标准。（OD600-0.08~0.13，300μL-500μL）再涂布均匀，超净台内适当晾干。将镊子于酒精灯火焰灭菌后降至室温，夹取药敏纸片对照模板贴到平血培养基表面，并使药敏片与培养基紧密相贴，记录每种药敏纸片的名称和顺序。（夹取不同种类的抗生素药敏纸片注意提前灼烧镊子，防止不同抗生素交叉污染）将平血培养基置于37℃温箱中培养16-24小时，观察并测定抑菌圈直径
4. 实验方法 1）抗生素药敏试验 • 倒MHA平板（每个平板约倒25 mL左右，倒2个平板）； • 可取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌涂布棒将待检 细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密，直接悬液法要 把菌液浓度用无菌生理盐水或PBS缓冲液调到0.5个麦氏标准。 （OD600=0.08~0.13，300 μL-500 μL）再涂布均匀，超净台内适当晾干。 • 将镊子于酒精灯火焰灭菌后降至室温，夹取药敏纸片对照模板贴到平皿 培养基表面，并使药敏片与培养基紧密相贴，记录每种药敏纸片的名称 和顺序。 (夹取不同种类的抗生素药敏纸片注意提前灼烧镊子，防止不同抗生素交叉 污染) • 将平皿培养基置于37℃温箱中培养16-24小时，观察并测定抑菌圈直径
1）抗生素药敏试验MANLIALDISKPLACEMENTTEMPLATEFORURBYBAUERCHISKDIFFUBION'TESTASMMicrobeLibrary@HudzickiASMMicroboLibraryDHudzlekiAASMMicrobeLibraryHudzickiASMMicrobeLibrary@HudzickiB
A B 1）抗生素药敏试验
药敏试验结果判断抑菌圈直径/mm菌种名称氯霉素头孢氨卡那霉素四环素氨苄青霉素大肠杆菌金黄色葡萄球菌
菌种名称 抑菌圈直径/mm 氨苄青霉素 头孢氨苄 氯霉素 卡那霉素 四环素 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 药敏试验结果判断