第十一章 生动物保护鶯中的 分子生物学披示 野生动物保护主要目的是应用科学 解决由于人类的干扰或其他因素引起的 物种、群落和生态系统问题,提供生物 多样性保护的原理和工具
第十一章 野生动物保护管理中的 分子生物学技术 野生动物保护主要目的是应用科学 解决由于人类的干扰或其他因素引起的 物种、群落和生态系统问题，提供生物 多样性保护的原理和工具
同工酶研究及应用 60年代中期后,应用于基因表达、系统分类 等位酶: 等位基因编码的同工酶,基因表达的直接产物,反映基因组成 差别,可做为系统分类依据,其位点按孟德尔方式遗传,绝大 多数位点共显性。分析等位酶位点,比较数值-—计算等位基 因、基因型频率-—估测种内、间遗传变异水平 OLD A、B二种亚基聚合成不同形式四聚体,实验步骤:动物ce11 缓冲液——离心-—取上清—聚丙烯胺电泳。 应用:赤狐、兔、鼬、犬科、熊科系统发育研究
同工酶研究及应用 60年代中期后，应用于基因表达、系统分类 等位酶： 等位基因编码的同工酶，基因表达的直接产物，反映基因组成 差别，可做为系统分类依据，其位点按孟德尔方式遗传，绝大 多数位点共显性。分析等位酶位点，比较数值---计算等位基 因、基因型频率---估测种内、间遗传变异水平； LDH： A、B二种亚基聚合成不同形式四聚体，实验步骤：动物cell--- 缓冲液----离心---取上清---聚丙烯胺电泳。 应用：赤狐、兔、鼬、犬科、熊科系统发育研究
RPLP遗传标记的研究和应用 (Restriction fragment length polymorphi sm) 限制性片段长度多肽性 已应用于人类遗传病的基因定位、基因诊断、法医生物一 物证验证、精细遗传图谱建立、遗传育种、物种进化 RFLP的获得:基因组DNA--已知的限制性内切酶消化 -电泳印迹-DNA探针 Southern杂交-DNA探针的 多态性图谱; 表现;基因组中DNA中与探针同源的DNA序列,经限制 性内切酶消化后长度的差 RFLP可看作遵循遗传规律的共“显性”性状,杂种F1代, 具有双亲的RFLP,在F1代自由分离,RFLP之间或与表 型性状之间存在连锁,RFLP是DNA水平上的研究
RFLP遗传标记的研究和应用 （Restriction fragment length polymorphism）： 限制性片段长度多肽性 ➢ 已应用于人类遗传病的基因定位、基因诊断、法医生物 物证验证、精细遗传图谱建立、遗传育种、物种进化； ➢ RFLP的获得：基因组DNA---已知的限制性内切酶消化- --电泳印迹----DNA探针Southern杂交----DNA探针的 多态性图谱； 表现；基因组中DNA中与探针同源的DNA序列，经限制 性内切酶消化后长度的差异； ➢ RFLP可看作遵循遗传规律的共“显性”性状，杂种F1 代， 具有双亲的RFLP，在F1代自由分离，RFLP之间或与表 型性状之间存在连锁，RFLP是DNA水平上的研究
PCR、RAPD、APLP技术及应用 PCR( Polymerase chain reaction):特异性 DNA体外圹增技术 >首先合成2个小片段的聚核苷酸引物(zobp)--二种引 物分别与待扩增的DNA片段(模板)正、负链两端互衤 引物片段与待扩增DNA片段混合加热变性=>退火=>引物 片段与相应DNA模板互补杂交,加入4种dNTP和DNA聚 酶=>DNA扩增=>再加热变性、退火-第一轮得到的 DNA扩增链又作为模板与引物片段杂交--进入第二轮 最后扩增DNA数量Y=(1+X),ⅹ:反应平均速率,n:反 应轮数 应用:微量DNA鉴定、检测,基因分离、克隆,DNA序列 分析,突变体、重组体的构造基因表达与调控,遗传病、 传染病的诊断,法医鉴定
PCR、RAPD、AFLP技术及应用 • PCR（Polymerase chain reaction）：特异性 DNA体外圹增技术 ➢ 首先合成2个小片段的聚核苷酸引物（Zobp）----二种引 物分别与待扩增的DNA片段（模板）正、负链两端互补--- -引物片段与待扩增DNA片段混合加热变性=>退火=>引物 片段与相应DNA模板互补杂交，加入4 种dNTP和DNA聚 合酶=>DNA扩增=>再加热变性、退火----第一轮得到的 DNA扩增链又作为模板与引物片段杂交----进入第二轮--- -最后扩增DNA数量Y=(1+X)n ，x：反应平均速率，n：反 应轮数； ➢ 应用：微量DNA鉴定、检测，基因分离、克隆，DNA序列 分析，突变体、重组体的构造基因表达与调控，遗传病、 传染病的诊断，法医鉴定
RAPD(Random amplified Polymorphism DNA): 建立在PCR基础上 用随机脱氧核苷酸序列作引物(10bp)--对所研究的基 因组DNA进行PCR扩增--扩增产物经琼脂糖凝胶或聚丙烯 酰胺凝胶电泳分离--染色或放射自显影检测扩増产物DN A 多态性,这些扩增DNA片段的多态性便反映了基因组相应 区域的DNA多态性。 RAPD不需要专门设计已知序列的引物,但对于特定引物, 它在基因组DNA序列上有其特定结合位点,只要这些位点 在基因组某些区域内的分布符合PCR扩增条件,可扩增出相 应的DNA片段,如果基因组在这些区域发生DNA片段的插 入、缺失或碱基突变可导致特定位点的分布发生改变,出现 扩增产物增、减或在分 上改变,单一引物可使检测区域 扩大到整个基因组,所以RAPD可对整个基因组DNA多态检 测 应用:遗传多样性分析,物种起源、进化、分类、育种
RAPD(Random amplified Polymorphism DNA)： 建立在PCR基础上 ➢ 用随机脱氧核苷酸序列作引物（10bp）---对所研究的基 因组DNA进行PCR扩增---扩增产物经琼脂糖凝胶或聚丙烯 酰胺凝胶电泳分离----染色或放射自显影检测扩增产物DNA 多态性，这些扩增DNA片段的多态性便反映了基因组相应 区域的DNA多态性。 ➢ RAPD不需要专门设计已知序列的引物，但对于特定引物， 它在基因组DNA序列上有其特定结合位点，只要这些位点 在基因组某些区域内的分布符合PCR扩增条件，可扩增出相 应的DNA片段，如果基因组在这些区域发生DNA片段的插 入、缺失或碱基突变可导致特定位点的分布发生改变，出现 扩增产物增、减或在分子量上改变，单一引物可使检测区域 扩大到整个基因组，所以RAPD可对整个基因组DNA多态检 测。 ➢ 应用：遗传多样性分析，物种起源、进化、分类、育种
.AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism 基因组总DNA--制性内切酶切割--形成分子量大 小不等的随机限制性片段--将特定的接头接在DNA片段 两端--形成带接头的DNA片段--通过接头序列和PCR引 物3未端识别-特异性片段经变性、淬火和延伸周期性 循环而扩增-电泳分离特异的限制性片段。 应用:目前未见用于动物实验
AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism） ➢ 基因组总DNA----限制性内切酶切割----形成分子量大 小不等的随机限制性片段----将特定的接头接在DNA片段 两端----形成带接头的DNA片段---通过接头序列和PCR引 物3’末端识别----特异性片段经变性、淬火和延伸周期性 循环而扩增----电泳分离特异的限制性片段。 ➢ 应用：目前未见用于动物实验
卫星DNA的研究及应用 ◇1、卫星DNA:1-5b本联重复微卫星,2 op NDR, 6—70bp小卫星DNA; ◇2、应用卫星DNA探针检测物种DNA的基本方法是制备 DNA指纹图 >获得基因组DNA分子或直接应用基因组文库的克隆DNA 分子,选用不能切割卫星位点內串联重复顺序,而能在卫 星位点以外进行切割的限制性内切酶,检测卫星区域长度 变化,反映岀νNTR酶切后经琼脂糖凝胶电泳,转到滤膜 上,用卫星探针杂交,通过放射自显影或显色获得的 Southern印迹,即为DNA指纹图。 应用:测核苷酸组成,构建基因连锁图,比较物种进化 系统分类等
卫星DNA的研究及应用 1、卫星DNA：1—5bp本联重复微卫星，2bp VNDR， 6—70bp 小卫星DNA； 2、应用卫星DNA探针检测物种DNA的基本方法是制备 DNA指纹图 ➢ 获得基因组DNA分子或直接应用基因组文库的克隆DNA 分子，选用不能切割卫星位点内串联重复顺序，而能在卫 星位点以外进行切割的限制性内切酶，检测卫星区域长度 变化，反映出VNTR酶切后经琼脂糖凝胶电泳，转到滤膜 上，用卫星探针杂交，通过放射自显影或显色获得的 Southern印迹，即为DNA指纹图。 ➢ 应用：测核苷酸组成，构建基因连锁图，比较物种进化， 系统分类等
基因组文库的构建 基因组文库( genomic Library): 含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体 杓建过程:提纯DNA-机械剪切或酶切-片段--与适当载 体(入噬菌体或 comid粘粒)相连-体外包装-转染细菌 组含有DNA片段的重组噬菌体颗粒。含有感兴趣基因 片段的重组子,可用标记探针与基因组文库中的重组子杂 交,筛选出来,所得克隆纯化、扩增、可进一步硏究。 〉应用:体细胞DNA提纯、建文库得以保存; 揭示细胞分化、个体发育,再组合重建物种
基因组文库的构建 基因组文库（genomic Library）： 含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体 ➢ 构建过程：提纯DNA--机械剪切或酶切--片段---与适当载 体（入噬菌体或comid粘粒）相连---体外包装---转染细菌 ---一组含有DNA片段的重组噬菌体颗粒。含有感兴趣基因 片段的重组子，可用标记探针与基因组文库中的重组子杂 交，筛选出来，所得克隆纯化、扩增、可进一步研究。 ➢ 应用：体细胞DNA提纯、建文库得以保存； 揭示细胞分化、个体发育，再组合重建物种