第三节酶活力其测定和分离纯化 一、酶活力与酶促反应速度 二、酶活力单位 三、酶的比活力 四、酶活力的测定方法 五、酶的分离纯化 p335
、酶活力与酶促反应速度 ●酶活力( enzyme activity):也称酶活性,是指酶催化一定化 学反应的能力。 ●酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反 应的反应速度来表示,两者呈线性关系。 ●酶促反应速度:单位时间、单位体积中底物的减少量或 产物的增加量。 单位:浓度/单位时间
、酶活力与酶促反应速度 ■酶活测定过程底物往往是过 量的,底物的减少量只占总 量的极小部分,不易测准。 产物浓度 ■相反产物从无到有,只要测 斜率=浓度时间=V 定方法足够灵敏,就可以准 确测定。在实际酶活测定中 般以产物的增加量为准。 时间 酪反应的速度曲线 研究酶促反应速度,以酶促反应的初速度为准(底物消耗 ≤5%)
二、酶的活力单位(U, activity unit) 口酶活力单位是根据某种酶在最适条件下,单位时间内被 酶作用的底物的减小量或产物的生成量来规定的. 口为了便于比较和统一活力标准,1961年国际酶学委员 会曾作过统一的规定:在标准条件下,一分钟内催化1微 摩尔底物转化的酶量定义为一个酶活力单位,亦即国际 单位{U).1|U=1 umol /min
三、酶的比活力( Specific activity) 比活力(SA):每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数。 单位:Umg蛋白质。 酶的比活力是分析酶的含量与纯度的重要指标。 也
五、酶活力的测定方法p336 口分光光度法( Spectrophotometry) 利用底物和产物在紫外或可见光部分的光吸收的不同,选择 一适当的波长,测定反应过程中反应进行的情况。 口荧光法( Fluorometry) 根据底物或产物的荧光性质的差别来进行测定。 口同位素法 用放射性同位素的底物。 口电化学法( Electrochemical method) 常用pH测定法,跟踪反应过程中H变化的情况
六、酶的分离纯化 口酶的分离纯是酶学研究的基础。 口酶的分离纯化即蛋白质的分离纯化:包括酶制剂的浓缩 与纯化。 口判断分离提纯方法的优劣的两个指标:总活力的回收, 比活力提高的倍数。 选材 破碎 抽提 保存 结晶 分离纯化 低温下进行!
六、酶的分离纯化 某一个酶的分离纯化分为4步。 步骤 2 总活力(U) 6 4 335 422 总蛋白质(mg) 20 10 比活力(umg) 6/204/103/52/2 酶的提纯过程中,总蛋白减少,总活力减少,比活力增高。 酶的纯化倍数: 每一步比活力 第一步比活力 酶的回收率:每步总活力×10%
七、核酶 Ribozyme(具有催化能力的核酸) Altman, Cech(1989) 有些RNA可具有催化能力 Tetrahymana thermophila四膜虫rRNA含有 intron 其 intron可自行催化切除( no protein!) →切下来的 intron可再进行催化反应(要认定专一性序列) Juang RH(2004)BCbasics
酶工程 口酶工程是将酶学原理与化学工程技术及基因重组技术有机 结合而形成的新型应用技术,是生物工程的支柱。 口酶的应用与新酶开发采用方法: ◆化学方法(化学酶工程):对酶的化学修饰或固定化 处理,改善酶的性质以提高酶的效率和降低成本。 ◆基因重组技术(生物酶工程):生产对酶以及对基因 进行修饰或设计新基因——生产性能稳定,具有新的 生物活性及催化效率更高的酶
