第三章抗生素产生菌的选育
第二章 抗生素产生菌的选育
今进行抗生素产生菌选育的原因: 1细菌耐药性逐年增加,致使一些抗生素的疗效 降低,甚至无效; 2条件病原菌的出现,尤其是在免疫力低下的 宿主中,已经导致了治疗感染性疾病中的严重问 题。(条件致病菌:有些细菌在正常情况下不 致病,但在特定条件下可以治病,这类细菌称为 条件致病菌或机会致病菌,比如居住部位的迁移; 机体免疫功能低下;菌群失调)
❖ 进行抗生素产生菌选育的原因： ❖ 1 细菌耐药性逐年增加，致使一些抗生素的疗效 降低，甚至无效； ❖ 2 条件病原菌的出现，尤其是在免疫力低下的 宿主中，已经导致了治疗感染性疾病中的严重问 题。 （条件致病菌：有些细菌在正常情况下不 致病，但在特定条件下可以治病，这类细菌称为 条件致病菌或机会致病菌，比如居住部位的迁移； 机体免疫功能低下；菌群失调）
发现微生物新药的新途径 各种筛选模型的建立,为发现微生物新药的多样 性提供了可能. 扩大微生物资源,为获得微生物药物的多样性提 供了可能微生物的多样性是提供微生物新药多样 性的基础。 冷利用组合生物合成技术,创造获得多样性的“非 天然”的天然化合物近年来组合生物合成是发现 微生物新药的研究热点之一。 今组合生物转化技术是发现微生物新药的有效途径
发现微生物新药的新途径 ❖ 各种筛选模型的建立，为发现微生物新药的多样 性提供了可能. ❖ 扩大微生物资源，为获得微生物药物的多样性提 供了可能微生物的多样性是提供微生物新药多样 性的基础。 ❖ 利用组合生物合成技术，创造获得多样性的“非 天然”的天然化合物近年来组合生物合成是发现 微生物新药的研究热点之一。 ❖ 组合生物转化技术是发现微生物新药的有效途径
微生物分类学 分离微生物 采集样凸 抗生素发酵选用不同培养基及培养条件) 、抗生素 全发酵液,上清液和菌丝体浸泡液 (或粗捷品等 生菌的筛 师选方法的建立 =筛选(采用微生物学、生物化学 选过程 生物学或化学方法等进行测定) 阳性样品 生物合成 早期鉴别 耐药机制 可能为新物质 化合物的分离与纯化 理化性质及生物学性质的定 新物质 临床前药理 毒性低 疗效好 结构改遣 开发研究
一、抗生素 产生菌的筛 选过程
抗生素的产生菌的来源 1放线菌 2细菌 冷3真菌
二 抗生素的产生菌的来源 ❖ 1 放线菌 ❖ 2 细菌 ❖ 3 真菌
、微生物的分离 (-)样品的采集 今土壤的营养:有机氮多--放线菌、细菌 有机氮少、酸性--真菌 今土壤深度: 放线菌和细菌--0-1m(80%在0-10cm) 真菌---0-0.3m 今未开垦过的土壤最佳 今南方地区土壤中的放线菌种类比北方多 今采样季节一春秋天为宜
（一）样品的采集 ❖ 土壤的营养：有机氮多----放线菌、细菌 ❖ 有机氮少、酸性----真菌 ❖ 土壤深度： 放线菌和细菌----0-1m（ 80%在0-10cm ） ❖ 真菌----0-0.3m ❖ 未开垦过的土壤最佳 ❖ 南方地区土壤中的放线菌种类比北方多 ❖ 采样季节一春秋天为宜 三、微生物的分离
(二)放线菌的分离 1样品分离前的处理 除去或减少不需要微生物,增加所需要放线菌的数量 (1)化学方法 SDS-酵母浸膏处理样品,可以使细菌数量明显减少 HV平板上55%~95%都是放线菌 风干的土壤与caCO3混合后培养,放线菌的数量可 以增加100倍。风干的土壤减少了细菌的数量 CaCO3有利于放线菌的生长,抑制了大多数真菌的 生长。 0.01 M NaoH处理土壤,分离小单孢菌,1M NaOH处理土壤可以分离到诺卡氏菌和小单孢菌 其他试剂:1.4%酚、乙酸乙酯可以使细菌和真菌数 量明显减少,有利于分离放线菌
（二）放线菌的分离 1 样品分离前的处理 除去或减少不需要微生物，增加所需要放线菌的数量。 （1）化学方法 ❖ SDS-酵母浸膏处理样品，可以使细菌数量明显减少， HV平板上55%~95%都是放线菌。 ❖ 风干的土壤与CaCO3混合后培养，放线菌的数量可 以增加100倍。风干的土壤减少了细菌的数量； CaCO3有利于放线菌的生长，抑制了大多数真菌的 生长。 ❖ 0.01M NaOH处理土壤，分离小单孢菌，1M NaOH处理土壤可以分离到诺卡氏菌和小单孢菌。 ❖ 其他试剂：1.4%酚、乙酸乙酯可以使细菌和真菌数 量明显减少，有利于分离放线菌
(2)物理方法 温度:根据各种微生物耐热程度的不同,用高温 处理样品,可以分离到不同种类的放线菌。 离心:根据微生物大小对样品进行离心分离。如 1600g离心20mn,上清液中主要是放线菌孢子 沉淀中含有细菌和真菌孢子。 膜过滤:用孔径为045um的滤膜可以浓缩水中 的微生物,过滤后把滤膜贴在平板培养基上培养 这种方法用来分离水中的小单孢菌和高温放线菌
（2）物理方法 ❖ 温度：根据各种微生物耐热程度的不同，用高温 处理样品，可以分离到不同种类的放线菌。 ❖ 离心：根据微生物大小对样品进行离心分离。如 1600g离心20min，上清液中主要是放线菌孢子， 沉淀中含有细菌和真菌孢子。 ❖ 膜过滤：用孔径为0.45μm的滤膜可以浓缩水中 的微生物，过滤后把滤膜贴在平板培养基上培养。 这种方法用来分离水中的小单孢菌和高温放线菌
2分离方法 (1)培养基 分离放线菌多采用合成培养基(精氨酸培养基、 高氏—号培养基、察氏培养基)和有机培养基 (如 Waksman培养基和 Benne培养基) (2)抗生素的加入 培养基中加入抗真菌抗生素和抗细菌抗生素,可 以抑制真菌和细菌的生长,对放线菌进行浓缩
2 分离方法 （1）培养基 分离放线菌多采用合成培养基（精氨酸培养基、 高氏一号培养基、察氏培养基）和有机培养基 （如Waksman培养基和Bennett培养基） （2）抗生素的加入 培养基中加入抗真菌抗生素和抗细菌抗生素，可 以抑制真菌和细菌的生长，对放线菌进行浓缩
(3)分离放线菌的方法 稀释法:无菌水稀释样品,然后涂布平板。 喷土法:用喷土机或其他方法把风干碾细的土样 直接喷在分离平板上。 ◆滤膜法:将0.22-0.45μm的滤膜放在分离培养 基的平板上,接种培养,放线菌菌丝可以穿过滤 膜长到培养基中,而细菌在滤膜表面生长,去掉 滤膜,培养基中的放线菌菌丝继续培养长出菌落。 (4)培养温度:一般25-30度,或者32-37度,培 养7-14天;高温放线菌需要45-50度培养1-2天 海水中分离放线菌用20度培养6周左右
（3）分离放线菌的方法 ❖ 稀释法：无菌水稀释样品，然后涂布平板。 ❖ 喷土法：用喷土机或其他方法把风干碾细的土样 直接喷在分离平板上。 ❖ 滤膜法：将0.22-0.45 μm的滤膜放在分离培养 基的平板上，接种培养，放线菌菌丝可以穿过滤 膜长到培养基中，而细菌在滤膜表面生长，去掉 滤膜，培养基中的放线菌菌丝继续培养长出菌落。 （4）培养温度：一般25-30度，或者32-37度，培 养7-14天；高温放线菌需要45-50度培养1-2天， 海水中分离放线菌用20度培养6周左右