分光光度法测定面中的 =32 复旦化学系 教学实验中心
实验14 分子荧光分光光度法测定面粉中的核黄素 分子荧光分光光度法测定面粉中的核黄素 分子荧光分光光度法测定面粉中的核黄素 （维生素 B2） 18:08:34 18:08:34 18:08:34 复旦化学系 教学实验中心
实验目的 方法原理 FL-4500荧光分光光度计 四、实验步骤 五、数据处理 六、思考题 :时:
一、实验目的 二、方法原理 三、FL-4500荧光分光光度计 四、实验步骤 五、数据处理 六、思考题 18:08:34 18:08:34 18:08:34
实验目的 掌握面粉样品的消化方法,了解溶液的p值等对核黄素 荧光强度的影响。 2.了解荧光分光光度计的主要结构及工作原理,掌握其正 确使用方法。 3.掌握荧光分析法基本原理和实验方法 :时:
一、实验目的 18:08:34 18:08:34 18:08:34 1. 掌握面粉样品的消化方法，了解溶液的pH值等对核黄素 荧光强度的影响。 2. 了解荧光分光光度计的主要结构及工作原理，掌握其正 确使用方法。 3. 掌握荧光分析法基本原理和实验方法
方法原理 1.荧光、荧光分子/荧光物质 2.荧光分析法:特点、定量方法 3.荧光分光光度计:结构、原理、操作 4.核黄素VB2:结构、性质、面粉中提取方法 :时:
二、方法原理 18:08:34 18:08:34 18:08:34 1. 荧光、荧光分子/荧光物质 2. 荧光分析法：特点 、定量方法 3. 荧光分光光度计：结构、原理、操作 4. 核黄素VB2：结构、性质、 面粉中提取方法
分子发光的基本原理 ◆第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家 N Monardes,1575年他提到在含有一种称为“ Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中,呈现了极为可爱的天蓝 色 ◆直到1852年, Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时,用分光光 度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些,才判断这 种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光,而不 是由光的漫射作用所引起的,从而导入了荧光是光发射的概 念,他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语 令1867年, Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作, 应用铝一桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 ◆19世纪以前,荧光的观察是靠肉眼进行的,直到1928年,才由 Jette和Wes提出了第一台荧光计
18:08:34 18:08:34 18:08:34 分子发光的基本原理 分子发光的基本原理 第一次记录荧光现象的是 第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家 世纪西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes N.Monardes ， 1575 年他提到在含有一种称为 年他提到在含有一种称为 “ Lignum Nephriticum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈 的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝 现了极为可爱的天蓝 色。 直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光 在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光 度计观察到其荧光的波长比入 度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这 射光的波长稍微长些，才判断这 种现象是这些物质在吸收光能 种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不 后重新发射不同波长的光，而不 是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概 是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概 念，他还由发荧光的矿石 念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。 1867年，Goppelsroder Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作， 进行了历史上首次的荧光分析工作， 应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到 世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由 Jette和West提出了第一台荧光计。 提出了第一台荧光计
分子发光的类型 光致发光 化学发光生物发光 按激发的模式分 热致发光 类: 场致发光 摩擦发光 荧光「瞬时荧光 按分子激发态的类型分类: 磷光迟滞荧光 按光子能量分类: 斯托克斯荧光 Stokes) 荧光 A emm 反斯托克斯荧光( Antistokes):4x> :时: em 量〓lba
18:08:34 18:08:34 18:08:34 分子发光的类型 分子发光的类型 按激发的模式分 按激发的模式分 类： 按分子激发态的类型分类： 按分子激发态的类型分类： 光致发光 化学发光/生物发光 热致发光 场致发光 摩擦发光 荧光 磷光 瞬时荧光 迟滞荧光 按光子能量分类： 按光子能量分类： 斯托克斯荧光(Stokes) (Stokes)： λex λem 共振荧光(R ) λ 荧光
荧光产生的机制——分子的活化与去活化过程 反系面】1 辐射跃迁的类型 振动弛豫/[内转私 窜趺共振荧光:1012sec 荧光 荧光:103sec 系间磷光 :1~104sec 跃迟滞荧光:102 c10-4seC 外可见吸收光谱紫外 2.无辐射跃迁的类型 振动驰豫:V1012sec 外转移:无辐射跃迁 迟 回到基态 滞荧光 内转移:S2~S能级 光 之间有重叠 可见共振 系间窜跃:S2T能级 之间有重叠 荧 I■■ 光 反系间窜跃:由外部获 光二 l■■■ 取能量后 :: 外转移 T1"S 2
18:08:34 18:08:34 18:08:34 荧光产生的机制 荧光产生的机制——分子的活化与去活化过程
分子荧光(磷光)光谱 1.荧光(磷光激发光谱与发射光谱 荧光(磷光)均为光致发光,在光辐射的作用下,荧光物质发射出不 同波长的荧光。 MX+hv;→MX MX→MX+hv F4800固定an=620nm(MAX A.激发光谱40 固定发射波长 3600 扫描激发波长 ex=290nm( MAX) 2800 2400 2000 1600 0+4+ 200250300350400450500550600650700750800850900 :时:
18:08:34 18:08:34 18:08:34 分子荧光(磷光)光谱 1. 荧光(磷光)激发光谱与发射光谱 激发光谱与发射光谱 荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不 同波长的荧光。 A. 激发光谱 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 0 400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200 3600 4000 4400 4800 IF λ 固定λ em=620nm(MAX) =620nm(MAX) λex =290nm (MAX) 固定发射波长 扫描激发波长 MX ⇒ MX* + ∑ = n i 1 hvi ∑ = ⇒ + n j 1 MX MX hv j *
B.发射光谱(荧光光谱) 固定激发波长扫描发射波长 发射光谱的形状与激发波长无关: 分子被激发到S1或者高于S的电子态,经过极快的内转换和振动弛豫 降到S1电子态的最低振动、转动能级,然后以辐射形式释放能量回到基 态 c.激发光谱与发射480固定m=620 nm(MAX)”固定4290mMAX 光谱的镜像关系 44001 1→4 4000 432 S 1→3 1→3 3200 2800 1→2 1600 1200 0 200250300350400450500550600650700750800850900 ■■■ ■圆■ Aox =290nm(MAX) Aem= 620nm(MAX)
18:08:34 18:08:34 18:08:34 B. 发射光谱(荧光光谱) 固定激发波长 扫描发射波长 C. 激发光谱与发射 激发光谱与发射 光谱的镜像关系 光谱的镜像关系 S0 43 2 1 S1 43 2 1 发射光谱的形状与激发波长无关： 分子被激发到S1或者高于S1的电子态，经过极快的内转换和振动弛豫 降到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基 态。 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 0 400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200 3600 4000 4400 4800 IF λ λ ex =290nm (MAX) 固定λ em=620nm(MAX) =620nm(MAX) 固定λ ex=290nm (MAX) λ em= 620nm(MAX) 1→ 4 1→ 3 1→ 2 1→1 1 →1 1 → 2 1 → 3 1 → 4
218荧 Aemnm (a)等角三维投影图 (b)等高线光谱图 三维荧光光谱的两种表示 分子荧光光度法的一些基本概念 ●激发光谱、荧光光谱、三维荧光光谱用途? :时:
18:08:34 18:08:34 18:08:34 三维荧光光谱的两种表示 （a）等角三维投影图 （b）等高线光谱图 分子荧光光度法的一些基本概念 z 激发光谱、荧光光谱、三维荧光光谱 用途？