荧光分光光度技术张培敏
荧光分光光度技术 张培敏
实验目的一、，1、了解荧光分光光度计的主要结构及工作原理2、掌握荧光光度计的操作技术3、掌握测定维生素片B2中核黄素的实验方法
一、实验目的 • 1、了解荧光分光光度计的主要结构及工作 • 原理 2、掌握荧光光度计的操作技术 3、掌握测定维生素片B2中核黄素的实验方 法
二、基本原理定性分析--根据激发曲线、发射曲线的特性(二)定量分析稀溶液中，荧光强度与浓度成正比·(三)荧光分析法的特点一一灵敏度高，选择性好
二、基本原理 • （一）定性分析——根据激发曲线、发射 曲线的特性 • （二）定量分析——稀溶液中，荧光强度 与浓度成正比 •（三）荧光分析法的特点——灵敏度高， 选择性好
()定性分析VR2S2分子激发态21ic0-0IVR21Si2分子激发态1T1TVRisc=01V=0F--A2Aiclisc小小32分子基态SoU=0A1A12图分子内的光物理过程A,A2吸收F一荧光P一磷光ic一内转化isc-体系间审联VR一振动弛豫
（一）定性分析
荧光（磷光）：光致发光照射光波长如何选择？1.荧光(磷光)的激发光谱曲线--入ex固定测量波长（选最大发射波长），化合物发射的（图中曲荧光（磷光）强度与照射光波长的关系曲线线1）激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；通过激发光谱，选择最佳激发波长一一发射荧光（磷光)强度最大的激发光波长，常用 入ex表示
荧光(磷光)：光致发光 照射光波长如何选择？ 1.荧光(磷光)的激发光谱曲线-λex 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的 荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲 线I ） 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多 ，荧光强度最大；通过激发光谱，选择最佳激发波 长——发射荧光(磷光)强度最大的激发光波长，常 用λex表示
2. 荧光光谱（或磷光光谱）一-入em固定激发光波长（选最1大激发波长），化合物发射的荧光（或磷光强度）与发II射光波长关系曲线（图中曲线II或II。通过发射光谱选择最佳的发射波长一一发射荧光(磷光)强度最300200400500a/nm大的发射波长，常用入em蔡的激发光谱（I）、荧光（和磷光（I）光谱图表示
2.荧光光谱(或磷光光谱)- λem 固定激发光波长(选最 大激发波长), 化合物发射 的荧光(或磷光强度)与发 射光波长关系曲线(图中曲 线II或III)。通过发射光 谱选择最佳的发射波长 — —发射荧光(磷光)强度最 大的发射波长，常用 λem 表示
荧光发射光谱磷光光谱荧光激发光谱200260320380440500560620室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 荧光激发光谱 荧光发射光谱 磷光光谱 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
3.激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量（如能级图几2，几1），产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光（如几‘）。C.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系
3.激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱 的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能 量 (如能级图 λ 2 ,λ 1)，产生不同吸收带，但均回到 第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态， 产生波长一定的荧光(如 λ ‘2 )。 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光 谱形状一样）成镜像对称关系
（二）、定量测定I = 2.3Φr Io ε bc=KCIf=荧光相对强度中f = 量子效率I。=入射光强度吸收系数=b=光程长C=浓度该式只有εbc<<0.05时才成立，即荧光测定只有在极稀溶液中才可测定，否则校正曲线向浓度轴弯曲
（二）、定量测定 I f = 荧光相对强度 φ f = 量子效率 I0 = 入射光强度 ε = 吸收系数 b = 光程长 c = 浓度 该式只有 εbc << 0.05时才成立，即荧光测定只 有在极稀溶液中才可测定，否则校正曲线向浓度 轴弯曲。 If = 2.3 φf I0 ε bc=KC
(三) 荧光分析法的特点1.灵敏度高前面已述，荧光分析法的灵敏度比吸光分析法高2～4个数量级，检测下限在0.1～0.001μgmL-1之间。主要原因有二：一是荧光信号是在暗背景下检测的，噪声小，较微弱的信号也能被检测，且可以高倍放大；二是荧光强度和激发光强度成正比关系，可以提高激发光的光强以增大荧光强度
（三）荧光分析法的特点 • 1. 灵敏度高 前面已述，荧光分析法的灵敏度比吸光分析法 高2～4个数量级，检测下限在0.1～0.001μg·mL-1 之间。主要原因有二： • 一是荧光信号是在暗背景下检测的，噪声 小，较微弱的信号也能被检测，且可以高倍放 大； • 二是荧光强度和激发光强度成正比关系，可 以提高激发光的光强以增大荧光强度