第二章 分子克隆载体 2001年10月1
第二章 分子克隆载体 2001年10月17日
分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并携 带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子 本章主要讲授内容 分子克隆载体的特点;分子克隆载体的种类 大肠杆菌分子克隆载体;细菌和链霉菌的分子克隆载 体;真菌分子克隆载体;植物克隆载体; 动物分子克隆载体; 克隆载体的选择;克隆载体的组建
分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并携 带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。 本章主要讲授内容： 分子克隆载体的特点; 分子克隆载体的种类; 大肠杆菌分子克隆载体; 细菌和链霉菌的分子克隆载 体；真菌分子克隆载体；植物克隆载体； 动物分子克隆载体； 克隆载体的选择；克隆载体的组建
第一节 分子克隆载体的特点
第一节 分子克隆载体的特点
发展概况 第一阶段(197年前):天然质粒和重组质粒的 利用,如pSC101,coE1,pCR,pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al) 2.第二阶段:增大载体容量(降低载体长度),建 立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列 载体。 3.第三阶段:进一步完善载体功能以满足基因工程克 隆中的不同要求,如M13mp系列载体,含T3,17, sp6启动子载体,表达型载体及各种探针型载体
一、发展概况 1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的 利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al) 2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建 立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列 载体。 3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克 隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7， sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体
载体特点 1.至少有一个复制起点,因而至少可在一种生物 体中自主复制。 2.至少应有一个克隆位点,以供外源DNA插入。 3.至少应有一个遗传标记基因,以指示载体或重 组DNA分子是否进入宿主细胞 ECoRI HindIII BamhI 大肠杆菌载体 Sall pBR322结构图 pB322 (4.36kb) or
二、载体特点 1. 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物 体中自主复制。 2. 至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3. 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重 组DNA分子是否进入宿主细胞 pBR322 BamHI SalI HindIII PstI ScaI Ampr ori (4.36 kb) 大肠杆菌载体 pBR322结构图
、遗传标记基因 1.标记基因的作用 1)指示外源DNA分子(载体或重组分子)是否进入 宿主细胞 这种指示可以是选择性的(Ap,Te,Kan), 也可以是非选择性的(如acZ) 2)指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子 这种指示也可以是选择性的(如TcS),也可以是非选 择性的(如Tcs, laclo,GUS),绝大多数为后者。 有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第 作用时,最好是选择性标记基因;当完成第二作用 时,目前多采用非选择性的一检测性标记基因。有的 基因是不能用作选择性标记基因(acZ,GUS等)
三、遗传标记基因 1. 标记基因的作用 1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入 宿主细胞 这种指示可以是选择性的（Apr ，Tcr ，Kanr）， 也可以是非选择性的（如lacZ） 2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 * 这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选 择性的（如TcS ，lacZα, GUS），绝大多数为后者。 **有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第 一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用 时，目前多采用非选择性的—检测性标记基因。有的 基因是不能用作选择性标记基因（lacZ，GUS等）
2.标记基因的种类 1)抗性标记基因(可直接用于选择转化子) a.抗生素抗性基因:Ap,Tc,Cmr,Kam,G418, HY eo b.重金属抗性基因:Cu,Zm,Cdr c.代谢抗性基因:TK,抗除草剂基因 2)营养标记基因(可直接用于选择转化子) 主要是参与氨基酸,核苷酸及其他必需营养物合成 酶类的基因,这类基因在酵母转化中使用最频繁,如 TRP1,URA3,LEU2,HS4等。 3)生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应,如acZ GUS, CAT 4)噬菌斑
2. 标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr ，Kanr ，G418r ， Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因 2）营养标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成 酶类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如 TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。 3）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ, GUS, CAT 4） 噬菌斑
3.使用标记基因注意要点 1)标记基因与宿主细胞 2)标记基因产物的作用机制:Ap 3)标记基因的结构与适用范围:基因启动子,翻译起始 序列,密码子偏爱性 4)标记基因的结构变化对功能的影响:LacZ,GUS 4.常用的遗传标记基因 1)四环素抗性基因(Tcr) Tetracycline可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质 分子上,抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 种399AAs蛋白质,与细菌细胞膜结合,阻止四环素 分子进入细菌细胞
3. 使用标记基因注意要点 1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始 序列, 密码子偏爱性 4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS 4. 常用的遗传标记基因 1) 四环素抗性基因（Tcr） Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质 分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素 分子进入细菌细胞
2)氨苄青霉素抗性基因(Apr) Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的 活性。Ap抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶, 催化β内酰胺环的水解,使氨苄青霉素失活。 3)氯霉素抗性基因(Cm) Chlorophenico可结合在核糖体50S亚基上,阻止蛋白 质合成。Cm基因编码氯霉素乙酰转移酶,使氯霉素《酰 化,导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。 4)卡那霉素(Kan新霉素(Neo)和G418抗性(G418基因 Kanamycin, Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡 萄糖苷类抗生素,可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。 来自转座子Tn5和Tn903的Kan抗性基因均可使这类抗生 素磷酸化,使之不能进入细胞内
2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr） Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的 活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶， 催化β—内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。 3) 氯霉素抗性基因（Cmr） Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白 质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰 化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。 4) 卡那霉素(Kanr ), 新霉素(Neor )和G418抗性(G418r )基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡 萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。 来自转座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生 素磷酸化，使之不能进入细胞内
5)β半乳糖苷酶基因(lacZ和 Lacto) β—半乳糖苷酶基因有1021AAs,基因产物不具酶活性, 装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分:a链和 β链。前者负责四聚体装配,后者具β半乳糖苷酶活性; 只有当两者都存在时,才会表现出酶活性,该作用称之为 -互补作用。这两个部分可独立存在,分别由两个基因编 码。为α链编码的基因称之为acZ(编码145AAs)。这两个 基因(LacZ和 Laczo)均可作为标记基因。 B半乳糖苷酶基因的优点 a.酶催化X-Gal水解为兰色产物,检测直观 b. laclo编码5端可容许很大的变化而不影响酶活性 c lacz和B链基因的分别表达可使载体小而容量大
5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性， 装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和 β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性； 只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为 α-互补作用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编 码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个 基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大