第七节 分子杂交技术
第七节 分子杂交技术
分子杂交种类 1.按其分子种类划分 1)DNA杂交一探针为DNA或RNA 2)RNA杂交一探针为DNA或cDNA DNA 日E ⊥LLL DNA或cDNA RNA 3)蛋自质免疫分析一探针为抗体 B二抗一酶E▲B二抗一酶B 蛋白质
一 . 分子杂交种类 1. 按其分子种类划分 1） DNA杂交—探针为DNA或RNA 2） RNA杂交—探针为DNA或cDNA RNA DNA DNA RNA 3） 蛋白质免疫分析—探针为抗体 蛋白质
2.按样品制备过程划分 1)原位杂交( Gin situ hybridization i.原位菌落杂交 原位噬菌斑杂交 原位细胞杂交 iv原位组织块杂交 原位裂解细胞,不需要分离DNA,RNA或蛋白质样品,可 同时处理大量样品,常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或 组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。 2)斑点杂交( dot hybridization 先分离DNA,RNA或蛋白质,然后将样品液直接点在 固体基质上进行杂交,不能测定分子量大小
2. 按样品制备过程划分 1） 原位杂交(in situ hybridization) i. 原位菌落杂交 ii. 原位噬菌斑杂交 iii. 原位细胞杂交 iv. 原位组织块杂交 原位裂解细胞，不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品，可 同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或 组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。 2）斑点杂交(dot hybridization) 先分离DNA，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在 固体基质上进行杂交，不能测定分子量大小
3)转移杂交或印迹杂交( blotting hybridization 先纯化样品,然后使不同大小的分子在凝胶上分离,转移到 固体基质上,与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。 用于转移的方法有: i.扩散法 i.毛细管法 i电泳转移法 ⅳv.真空转移法 4)夹心杂交法( (sandwich hybridization) 它利用两种探针与待测DNA结合,先将不带 标记的探针固定在基质上,然后用待测样品 与之杂交,洗去非特异性结合后,再与第二 种带标记的探针杂交。这种方法可用于粗制 DNA样品,可检测出02ng的DNA样品
3）转移杂交或印迹杂交(blotting hybridization) 先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到 固体基质上，与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。 用于转移的方法有： i. 扩散法 ii. 毛细管法 iii. 电泳转移法 iv. 真空转移法 4) 夹心杂交法(sandwich hybridization) * 它利用两种探针与待测DNA结合，先将不带 标记的探针固定在基质上，然后用待测样品 与之杂交，洗去非特异性结合后，再与第二 种带标记的探针杂交。这种方法可用于粗制 DNA样品，可检测出0.2ng的DNA样品
3.分子杂交的一般程序 1)DNA和RNA的杂交 制备DNA或RNA样品与固定基质结合80℃真空固定→ 预杂交→加入标记探针杂交洗涤放射自显影或显色反应。 2)蛋白质的免疫分析 制备蛋白质样品→与固定基质结合常温空气中固定→封闭 剂封闭→一抗反应一洗涤二抗-酶偶联物反应洗涤显色反 应(EIA) 或→一抗放射标记物洗涤→放射自显影(RIA 杂交样品膜的制备 1.固定基质的种类与特性 1)硝酸纤维素滤膜( Nitrocellulose filter,NCF) 可与三类大分子的结合,其机理不清楚,可能为被动吸附。 NCF不能结合小分子DNA,RNA和蛋白质(<20,000
3. 分子杂交的一般程序 1) DNA和RNA的杂交 制备DNA或RNA样品→与固定基质结合→80℃真空固定→ 预杂交→加入标记探针杂交→洗涤→放射自显影或显色反应。 2）蛋白质的免疫分析 制备蛋白质样品→与固定基质结合→常温空气中固定→封闭 剂封闭→一抗反应→洗涤→二抗-酶偶联物反应→洗涤→显色反 应（EIA） 或 → 一抗放射标记物→洗涤→放射自显影（RIA） 二. 杂交样品膜的制备 1. 固定基质的种类与特性 1）硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulose filter, NCF) 可与三类大分子的结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。 NCF不能结合小分子DNA，RNA和蛋白质（<20,000）
优点:i用于DNA,RNA杂交分析时结果可靠,灵敏,本底低。 i用于蛋白质分析时,容量大(80μg/m2);可直接染色; 分辨率高;不需要预激活;易于操作 缺点:结合低分子蛋白质不稳定,反复使用探针次数有限(2-3 次) 2)重氮化纸:DBM纸与DPT纤维素纸 最大特点是能结合小分子的DNA,RNA和蛋白质,共价 结合,可用不同探针进行多次杂交分析。该类基质结合 生物大分子的能力差,需要激活,分析蛋白质时最好用 放射性标记物。这类基质对生物大分子是主动吸附。 3)尼龙膜 阳离子尼龙膜(如zeta-prob,zeta-bind等)
优点：i. 用于DNA，RNA杂交分析时结果可靠，灵敏，本底低。 ii. 用于蛋白质分析时，容量大（80μg/cm2 )；可直接染色； 分辨率高；不需要预激活；易于操作 缺点： 结合低分子蛋白质不稳定，反复使用探针次数有限（2-3 次） 2）重氮化纸：DBM纸与DPT纤维素纸 最大特点是能结合小分子的DNA，RNA和蛋白质，共价 结合，可用不同探针进行多次杂交分析。该类基质结合 生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白质时最好用 放射性标记物。这类基质对生物大分子是主动吸附。 3) 尼龙膜 i. 阳离子尼龙膜（如Zeta-prob,Zeta-bind等）
i)容量大,蛋白质可结合480pg/cm2 i)可结合不同大小的DNA(6n),RNA和蛋白质。 i)l韧性好 iv)可用于电转移 v)可进行反复多次杂交试验 vi)广泛的化学耐受性和可高温消毒 不能用于蛋白质的直接染色。 i.)龙66 广泛用于核酸印迹分析,静电荷可从p4时阳离子状态转变 为pH7时阴离子状态,电转移时要注意 4)离子膜 i.DEAE纤维素纸(可用于sDNA, dS-DNA,RNA的制备回收) i.CM纤维素纸(可用于碱性蛋白质的结合)
i) 容量大, 蛋白质可结合480μg/cm2 ii) 可结合不同大小的DNA(6n.t.)，RNA和蛋白质。 iii) 韧性好 iv) 可用于电转移 v) 可进行反复多次杂交试验 vi) 广泛的化学耐受性和可高温消毒 *不能用于蛋白质的直接染色。 ii. 尼龙66 广泛用于核酸印迹分析，静电荷可从pH4时阳离子状态转变 为pH7时阴离子状态，电转移时要注意。 4）离子膜 i. DEAE-纤维素纸(可用于ss-DNA, ds-DNA, RNA的制备回收) ii. CM-纤维素纸(可用于碱性蛋白质的结合)
2.固定基质的选择依据 1)强度,耐久性,操作简便 2)高信噪比(低本底高信号) 3)生物大分子的结合容量和稳定性 4)重现性好 3.各种杂交样品膜的制备 1)原位杂交样品膜的制备 i.原位菌落杂交样品膜 布基因组 文库或cDNA 文库克隆 扩增质粒 0.5-1mm (不必要 影印 37℃至 LB+AP NCF 37℃ 过夜 Ap\培养B+AP Cm NCF 涂菌 保存平板待用
2. 固定基质的选择依据 1）强度，耐久性，操作简便 2）高信噪比（低本底高信号） 3）生物大分子的结合容量和稳定性 4）重现性好 3. 各种杂交样品膜的制备 1）原位杂交样品膜的制备 i. 原位菌落杂交样品膜 涂布基因组 文库或cDNA 文库克隆 LB+AP 37℃ 过夜 0.5-1mm 影印 NCF LB+AP 37℃至 0.5-1mm Apr Cmr 扩增质粒 (不必要） NCF 涂菌 Apr 培养 保存平板待用
III 80℃真 空干燥 10% SDS 0. 5N NaoH IM Tris pH7. 4 1. 5M NaCl+ 0. 5M Tris pH7. 4 细胞培养(高密度,几百一十万个菌落或低密度,几百 个以下) i)细菌细胞原位裂解与DNA变性 i.原位噬菌斑杂交样品膜 i)细胞感染和噬菌斑形成(10,00020,00平板) i)噬菌体转移—用NCF作影印 iDNA变性与固定(与上同)
i) 细胞培养（高密度，几百—十万个菌落或低密度，几百 个以下） ii) 细菌细胞原位裂解与DNA变性 ii. 原位噬菌斑杂交样品膜 i) 细胞感染和噬菌斑形成（10,000-20,000/平板） ii) 噬菌体转移—用NCF作影印 iii) DNA变性与固定（与上同） I II III IV 5' 5' 5' 10% SDS 0.5N NaOH 1M Tris pH7.4 1.5M NaCl+ 0.5M Tris pH7.4 80℃真 空干燥
2)斑点杂交样品膜的制备 制备样品→点样→固定(可用斑点杂交仪或直接点样) NCF 点样板 96孔 滤纸 支撑板 12×8 至真空泵 废液储槽 3)转移杂交样品膜的制备 i.扩散法( Difusion blotting method) 3M滤纸 NCF 用于转移蛋白质, 凝胶 全部装置浸在缓 冲液中1.5-2天 3M滤纸
2） 斑点杂交样品膜的制备 制备样品→点样→固定（可用斑点杂交仪或直接点样） NCF 滤纸 点样板 支撑板 至真空泵 废液储槽 96孔 12×8 3）转移杂交样品膜的制备 i. 扩散法（Difusion blotting method ) 3MM滤纸 NCF 凝胶 NCF 3MM滤纸 用于转移蛋白质， 全部装置浸在缓 冲液中1.5-2天