获得基因的一般方法 1.化学合成方法 主要用于较小基因的合成,或需改变密码子的基因。 2.半化学合成法 mRNA→CDNA→加人工接头或合成一段DNA→ 与载体相连 3.筛选法 用于各种方法从基因组文库或cDNA文库中选择目 的基因
一．获得基因的一般方法 1. 化学合成方法 主要用于较小基因的合成，或需改变密码子的基因。 2. 半化学合成法 mRNA → cDNA → 加人工接头或合成一段DNA → 与载体相连 3. 筛选法 用于各种方法从基因组文库或cDNA文库中选择目 的基因
二.基因的筛选方法 1.遗传互补法 1)原理 当把一外源DNA片段引入一受体细胞后,如果受体 细胞获得某种新的性状,那么此片段上携带着决定新性 状的遗传基因。 i.营养缺陷型受体细胞外源DNA→转化细胞涂布 在合成培养基上→原养型细胞生长 i受体细胞(无某种表型)+外源DNA→转化细胞 涂布在特殊培养基上→具有新性状细胞 ⅲ虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性,但当转 入目的基因后,该细胞可过量产生此酶活性,这亦可用
二．基因的筛选方法 1. 遗传互补法 1) 原理 当把一外源DNA片段引入一受体细胞后，如果受体 细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带着决定新性 状的遗传基因。 i. 营养缺陷型受体细胞+外源DNA → 转化细胞涂布 在合成培养基上→ 原养型细胞生长 ii. 受体细胞（无某种表型）+ 外源DNA → 转化细胞 涂布在特殊培养基上→ 具有新性状细胞 iii. 虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性，但当转 入目的基因后，该细胞可过量产生此酶活性，这亦可用
于基因筛选。如酿酒酵母的MFa基因就是如此筛选到的 实例:基因组文库DNA→转化酿酒酵母细胞(le2,eu) 转化细胞(leu2/EU2,Leut)LEU基因 基因组文库DNA一转化Ecoi(无纤维素酶活性)→ 转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈一纤维素酶基因 优点:简便,快速,可靠,是首选方法。获得的基因 定是完整基因。 缺点:适用范围较窄。 必备条件:外源基因不仅能在受体细胞表达,而且必 须具备生物学活性
实例：基因组文库DNA → 转化酿酒酵母细胞（leu2,Leu-） → 转化细胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因 基因组文库DNA →转化E.coli（无纤维素酶活性）→ 转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈 →纤维素酶基因 优点：简便，快速，可靠，是首选方法。获得的基因 一定是完整基因。 缺点：适用范围较窄。 必备条件：外源基因不仅能在受体细胞表达，而且必 须具备生物学活性。 于基因筛选。如酿酒酵母的MFα基因就是如此筛选到的
2)分离步骤 分离基因组文库重组DNA分子→转化适当宿主细胞→涂布在 选择培养基上一随机挑选阳性克隆,分离重组DNA分子一再转 化相同受体细胞→高频转化子一基因的进一步证实和鉴定 重组DNA转化细胞 SDS-PAGE→出现新蛋白质带 原载体转化细胞(分别制备无细胞抽提物酶活测定酶活性出现 非转化细胞(二) 免疫分析与特定抗原反应 鉴定工作包括:限制酶图谱,基因定位, Southern杂交, 序列测定
2) 分离步骤 分离基因组文库重组DNA分子→ 转化适当宿主细胞 → 涂布在 选择培养基上→随机挑选阳性克隆，分离重组DNA分子→再转 化相同受体细胞→ 高频转化子→基因的进一步证实和鉴定 重组DNA转化细胞 SDS-PAGE →出现新蛋白质带 原载体转化细胞(一) 分别制备无细胞抽提物 酶活测定→酶活性出现 非转化细胞（二） 免疫分析→与特定抗原反应 鉴定工作包括：限制酶图谱，基因定位，Southern杂交, 序列测定
2.核酸杂交法 1)原理 利用核酸探针与待分离DNA的同源序列可进行杂交 的特点分离目的基因(同源序列不是完全相同序列) 优点:不需要基因表达 必备条件:合适的核酸探针或有关资料,外源DNA能在 宿主细胞中扩增 2)核酸探针种类 i.DNA探针:分离自某一种生物 i寡核苷酸探针:根据目的基因编码蛋白质的部分氨基 酸序列推测
2．核酸杂交法 1)原理 利用核酸探针与待分离DNA的同源序列可进行杂交 的特点分离目的基因（同源序列不是完全相同序列） 优点：不需要基因表达 必备条件：合适的核酸探针或有关资料，外源DNA能在 宿主细胞中扩增 2)核酸探针种类 i. DNA探针: 分离自某一种生物 ii.寡核苷酸探针: 根据目的基因编码蛋白质的部分氨基 酸序列推测
如: Leu-Va1- Phe-His-Asp-Ala六肽 QUN-GUN- UUQ-CAQ-GAQ-GCN对应 mRNA N:ACGT/U CAN-AP- GTP-CTP-CG探针序列Q:CT/UP:AG 32种14聚体混合物,其中必有一种14聚体与待测DNA完全互补 选择的肽段中氨基酸的简并密码子应最少。 这种探针最好用于目的cDNA分离。若用于分离基因,要 事先考虑到此探针序列横跨内含子序列的可能。 此种探针亦可根据其他来源相同基因的保守序入设计。 CDNA探针:利用特异性mRNA反转录而成,亦可用不 同mRNA混合物反转录而成 iV, PCR探针 V.RNA探针:由T3或T7启动子和相应聚合酶转录其下游 基因片段而得
如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala 六肽 QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN 对应mRNA N：ACGT/U CAN-AAP-GTP-CTP-CG 探针序列 Q：CT/U P：AG 32种14聚体混合物，其中必有一种14聚体与待测DNA完全互补 * 选择的肽段中氨基酸的简并密码子应最少。 **这种探针最好用于目的cDNA分离。若用于分离基因，要 事先考虑到此探针序列横跨内含子序列的可能。 ***此种探针亦可根据其他来源相同基因的保守序列设计。 iii. cDNA探针: 利用特异性 mRNA反转录而成，亦可用不 同mRNA 混合物反转录而成 iv. PCR探针 v. RNA探针: 由T3或T7启动子和相应聚合酶转录其下游 基因片段而得
3)分离步骤 基因(基因组或cDNA文库一制备DNA样品膜与标记探针 杂交一杂交斑点(阳性克隆)一分离重组DNA分子→作斑 点杂交→阳性克隆 Southern杂交以确认杂交结果→DNA 进一步证实和鉴定:核酸序列分析,与蛋白质一级结构比 较;分离插入片段进行基因表达,用免疫方法或其他方法 检测表达产物 3.免疫法 1)原理 外源DNA引人宿主细胞后表达出蛋白质,以此为抗 原与相应的抗体发生免疫反应,然后利用二抗与一抗反应, 用二抗偶联的酶反应筛选目的DNA
3) 分离步骤 基因(基因组或cDNA)文库→制备DNA样品膜→与标记探针 杂交 →杂交斑点（阳性克隆）→分离重组DNA分子→ 作斑 点杂交→阳性克隆→Southern杂交以确认杂交结果→ DNA 进一步证实和鉴定：核酸序列分析，与蛋白质一级结构比 较；分离插入片段进行基因表达，用免疫方法或其他方法 检测表达产物 3. 免疫法 1) 原理 外源DNA引人宿主细胞后表达出蛋白质，以此为抗 原与相应的抗体发生免疫反应, 然后利用二抗与一抗反应， 用二抗偶联的酶反应筛选目的DNA
优点:不依赖于基因表达产物的生物学活性,只要抗原决 定序列能被正确表达。 外源DNA可以是一个完整编码区,也可能是一个外显 子,这些序列可以插入Eco表达型载体。 必备条件:待分离基因的表达产物蛋白质必须纯化和用 于制备相应抗体。 2)分离步骤 基因文库蛋白质样品膜制备→免疫法筛选有色斑 点(阳性克隆)一进一步证实:分离阳性克隆无细胞 抽提物,作斑点印迹, western印迹免疫分析;分离重 组DNA,检测插入片段大小,测序等
优点：不依赖于基因表达产物的生物学活性,只要抗原决 定序列能被正确表达。 * 外源DNA可以是一个完整编码区，也可能是一个外显 子，这些序列可以插入E.coli表达型载体。 必备条件：待分离基因的表达产物—蛋白质必须纯化和用 于制备相应抗体。 2) 分离步骤 基因文库→蛋白质样品膜制备→免疫法筛选→有色斑 点（阳性克隆）→进一步证实：分离阳性克隆无细胞 抽提物，作斑点印迹，western印迹免疫分析；分离重 组DNA，检测插入片段大小，测序等
4.染色体巡查法( chromosome walking) 1)原理 利用DNA探针筛选对应重组DNA,然后以插入片段两末 端片段为探针选择对应重组DNA,此次筛选的DNA插入片 段仅以一端为探针,继续和重复该过程,直至筛选到目的基 因 优点:可获得染色体中一段DNA的限制酶图谱,对基因组全序 列测定十分有用 缺点:工作量大,鉴定困难,当巡查高等真核生物染色体时, 重复DNA序列区域难以跨越。 必要条件:两基因间距离应清楚。 该法的两大难点:限制酶图制作和末端片段探针制备。前者 可用改进的载体,后者可用RNA聚合酶合成末端探针 2)操作步骤
4. 染色体巡查法(chromosome walking) 1) 原理 利用DNA探针筛选对应重组DNA，然后以插入片段两末 端片段为探针选择对应重组DNA，此次筛选的DNA插入片 段仅以一端为探针，继续和重复该过程，直至筛选到目的基 因 优点：可获得染色体中一段DNA的限制酶图谱，对基因组全序 列测定十分有用 缺点：工作量大，鉴定困难，当巡查高等真核生物染色体时， 重复DNA序列区域难以跨越。 必要条件：两基因间距离应清楚。 * 该法的两大难点：限制酶图制作和末端片段探针制备。前者 可用改进的载体，后者可用RNA聚合酶合成末端探针 2) 操作步骤
染色体巡查示意图 RE RE 3 第一次巡查 以G基因上下游片段为探针 第二次巡查 n次巡查
RE RE G 5' 3' 3' 5' 第一次巡查 以G基因上下游片段为探针 第二次巡查 G1 n次巡查 G2 G1 G G2 染色体巡查示意图