第二十二章 常用分子生物学术的 原况应用 The popular Technology in Molecular (Biology: Principle ad Application
第二十二章 常用分子生物学技术的 原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and Application
第 节 分子条交与即迹教术 Molecular hybridization &z, Blotting Technol
第 一 节 分子杂交与印迹技术 Molecular Hybridization & Blotting Technology
、分子亲突与即迹术的原理 核酸分子亲( nucleic acid hy6 oxidization) 在⑩复冠程中,如果把不同①单辘 分子放在同一溶液中,或把①与欢在一 起,只要在①M或的单分子之间有一定 的碱基配对系,就可以在不同的分子之阊形 成化双( heteroduplex o
核酸分子杂交(nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链 分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形 成杂化双链(heteroduplex) 。 一、分子杂交与印迹技术的原理
T!TTT 复性 A RNA DNA
复性 RNA DNA
()即癔术 Blotting 首先由 wen souther在1975提幽。 Blotting即“即渍,措牾存在于凝胶中的生物 大分子转彩(印渍)到固定代介质是滴加以检 测分祈的莪术,目前广泛应用手N、RA 和蛋白质的检测
（一）印渍技术 Blotting ▪ 首先由Edwen Southern在1975年提出。 ▪ Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物 大分子转移（印渍）到固定化介质是病加以检 测分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、 和蛋白质的检测
探针技术 00e 将一小股民知序列的核酸片股用敭射咝 同丘橐、生粉橐或荧咒料对它的末瑞 或全甕號行标,称为“镪针”尜 后用导分子条交,亲交后通冠射自显 彩、荧咒检测或显色教术,使交区带 显出来
探针技术 probe ▪ 将一小段已知序列的核酸片段用放射性 同位素、生物素或荧光染料对它的末端 或全链进行进行标记，称为“探针”然 后用于分子杂交，杂交后通过放射自显 影、荧光检测或显色技术，使杂交区带 显现出来
二、即渍敦术冽应用 N印迹术 Southern6tt 只v印迹术 northerm 60 tting 蛋自质即迹牧木 Western blotting 班京即迹ot60t 原泰 in situ hy6 ridization ①M点阵 DNA array ①艾片技术①ch
二、印渍技术的类别及应用 ▪ DNA印迹技术 Southern blotting ▪ RNA印迹技术 Northern blotting ▪ 蛋白质印迹技术 Western blotting ▪ 斑点印迹 Dot blotting ▪ 原位杂交 in situ hybridization ▪ DNA点阵 DNA array ▪ DNA芯片技术 DNA chip
(~)①即迹术 Southern blotting 又称为Stm秦交,即①①突 分析。是研兜⑩国熸的基本术,至 要用于基固组的分析,如在基因组 中特异基因的定侁及检测葶,亦可用手 分析重组质靴和喷菌体。在陟殄断 图分析况CR产物分析等面弃 重要价值
（一）DNA印迹技术 Southern blotting ▪ 又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交 分析。是研究DNA图谱的基本技术，主 要用于基因组DNA的分析，如在基因组 中特异基因的定位及检测等，亦可用于 分析重组质粒和噬菌体。 在遗传诊断 DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有 重要价值
基本亦法 将DM标本用照制瞧內切贾化后,经琼脂糖 胶电分离容蓐解毕段; 经碱变唯,qis缓冲液中和,高盐下通冠毛吸作用 得①M从胶中转即至臂酸纤维橐朦上,烘予 固定,胶中①M股的相对丘置在①M片股转 彩到摅隴的过程中纔保持着。 附着在滤隙上的①M与3标记的操针灾,利用 放射自显影术确定探针互科的每条带的『, 确定在众多酶解产物中含幕一特定序列的①M片 的丘置和大小
基本方法 ▪ 将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝 胶电泳分离各酶解片段； ▪ 经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用 将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干 固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转 移到滤膜的过程中继续保持着。 ▪ 附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用 放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置， 确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片 段的位置和大小
Southern blotting 无水乙醇 酚/氯仿 蛋白酶K SDS 离心 tissue 89 DNA Cleave with restriction enzymes Nitrocellulose Autoradiography Hybridize with labeled DNA or Filter paper Nitrocellulose RNA probe: perform Gel autoradiography Alkaline solution Capillary action transfers DNA from gel to nitrocellulose
Paper Towels Southern Blotting tissue 酚/氯仿 蛋白酶K SDS 无水乙醇 离心