分子生物学实验讲义 Experimental Direction of Molecular Biology 昆明医学院基础学院 生物化学教研室 Department of biochemistry Faculty of Basic Medical Sciences, Kunming Medical College 2007年3月
分子生物学实验讲义 Experimental Direction of Molecular Biology 昆明医学院基础学院 生物化学教研室 Department of Biochemistry Faculty of Basic Medical Sciences, Kunming Medical College 2007 年 3 月
实验一质粒DNA的提取与限制酶切鉴定 Isolation of Plasmid DNA and Identification by restriction Digestion 目的( Objective) 掌握质粒DNA小量快速提取法;了解DNA限制性核酸内切酶酶切鉴定原理 二、原理 Principles)) 质粒( plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子。其分子量大小在1-200kb之间。是 具有双链闭合环状结构的DNA分子,质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,具有自主 复制和转录能力,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数,可表达它携带的遗传信息。质粒 般独立游离在细胞质内,也可整合到细菌染色体中,它离开宿主的细胞就不能存活,而它控 制的许多生物学功能却赋予宿主细胞某些表型 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增:收集和裂解细菌 分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁,十二烷基硫酸钠( Sodium dodecy l sulfate,SDsS)可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂(SDS)处理后,细菌DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀出来,而质粒DNA则留在上清液中。再经酒精沉 淀、洗涤处理,可得到质粒DNA。 共价闭环DNA( covalently closed circular dNA,简称 CCcDNA)质粒以超螺旋形式存 在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,这种松弛型 的DNA分子叫作开环DNA( open circular DNA,简称 OCDNA)。在电泳时,同一质粒如以 CccDNA形式存在,它比其开环和线状DNA的泳动速度都快,因此在本实验中,质粒DNA在 电泳凝胶中呈现3条区带。 限制性内切酶是分子生物学研究中的一种工具酶,这类酶的特点是具有能够识别双链 DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力,能在这个特异性核苷酸序列内,切断DMA的双链,形 成一定长度的DMNA片段。如: EcoR I和HindⅢ的识别序列和切口是 EcoR I:G↓A AATTC HindI:A↓ AGCTT 限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口,就能产生多少酶切片段,因此鉴定酶切后的 片段在电泳凝胶的区带数,就可以推断酶切口的数目,从片段的迁移率可以大致判断酶切片 段大小的差别。用已知分子量的线状DNA为对照,通过电泳迁移率的比较,就可以粗略推测 分子形状相同的未知DNA的分子量。 三、主要设备、实验材料和试剂( Equipments, Mater ia Is and Agents)
实验一 质粒 DNA 的提取与限制酶切鉴定 Isolation of Plasmid DNA and Identification by Restriction Digestion 一、 目的(Objectives) 掌握质粒 DNA 小量快速提取法；了解 DNA 限制性核酸内切酶酶切鉴定原理。 二、 原理(Principles)) 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子。其分子量大小在 1－200kb 之间。是 具有双链闭合环状结构的 DNA 分子，质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，具有自主 复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。质粒一 般独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控 制的许多生物学功能却赋予宿主细胞某些表型。 所有分离质粒 DNA 的方法都包括 3 个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌； 分离和纯化质粒 DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate, SDS）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌 DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒 DNA 则留在上清液中。再经酒精沉 淀、洗涤处理，可得到质粒 DNA。 共价闭环 DNA（covalently closed circular DNA，简称 cccDNA）质粒以超螺旋形式存 在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型 的 DNA 分子叫作开环 DNA（open circular DNA, 简称 ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以 cccDNA 形式存在，它比其开环和线状 DNA 的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒 DNA 在 电泳凝胶中呈现 3 条区带。 限制性内切酶是分子生物学研究中的一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链 DNA 分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断 DNA 的双链，形 成一定长度的 DNA 片段。如：EcoRⅠ和 HindⅢ的识别序列和切口是： EcoRⅠ：G↓AATTC HindⅢ：A↓AGCTT 限制性内切酶对环状质粒 DNA 有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的 片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片 段大小的差别。用已知分子量的线状 DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测 分子形状相同的未知 DNA 的分子量。 三、 主要设备、实验材料和试剂（Equipments, Materials and Agents）
1.主要设备( Equipments) (1)塑料离心管1.5mL×30 (2)塑料离心管架×1 (3)微量加样器10μL、100μL、1000μL各一支 (4)常用玻璃仪器及滴管等 (5)台式高速离心机(16000r/min) (6)电泳仪 (7)电泳槽 (8)样品槽模板 2.材料( Materials):质粒转化大肠杆菌 3.试剂( Agents) (1)溶液I:pH8.0G.E.T缓冲液(50mmol/L葡萄糖,10mmol/ L EDTA,25mol/ L Tris-HCl) 用前加溶菌酶4ng/mL (2)溶液Ⅱ:1mol/ L NaOH40μ1,5%SDs40μ1,蒸馏水120μ1,临用时配制。 (3)溶液Ⅲ:p4.8乙酸钾溶液(60mL5mol/LKAc,11.5n冰乙酸,28.5mLH20) (4)苯酚/氯仿(1:1,V/V):苯酚需在160℃重蒸,加入抗氧化剂8-羟基喹啉,使其浓 度为0.1%,并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇,氯仿/异戊醇(24:1,v/V)。 (5)pH8.0T缓冲液:10mol/ L Tris,lmol/ EDTA,其中含有RNA酶( RNase) (6)TAE电泳缓冲液 (7)DNA染色试剂 Sybr Green或EB染色液: (8)10X上样缓冲液 (9)DNA分子量标准物( DNA Marker) 四、操作步骤 Methods)
1．主要设备(Equipments) （1）塑料离心管 1.5mL×30 （2）塑料离心管架×1 （3）微量加样器 10μL、100μL、1 000μL 各一支 （4）常用玻璃仪器及滴管等 （5）台式高速离心机（16 000r/min） （6）电泳仪 （7）电泳槽 （8）样品槽模板 2．材料(Materials)：质粒转化大肠杆菌 3．试剂(Agents) （1）溶液Ⅰ：pH8.0 G.E.T 缓冲液（50mmol/L 葡萄糖，10 mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl）； 用前加溶菌酶 4mg/mL。 （2）溶液Ⅱ:1mol/L NaOH 40μl , 5%SDS 40μl ,蒸馏水 120μl，临用时配制。 （3）溶液Ⅲ：pH 4.8 乙酸钾溶液（60mL 5mol/L KAc，11.5mL 冰乙酸，28.5mL H2O） （4）苯酚/氯仿（1∶1，V/V）：苯酚需在 160℃重蒸，加入抗氧化剂 8-羟基喹啉，使其浓 度为 0.1%，并用 Tris-HCl 缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇（24∶1，V/V）。 （5）pH 8.0 TE 缓冲液：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，其中含有 RNA 酶（RNase）20 μg/mL。 （6）TAE 电泳缓冲液： （7）DNA 染色试剂 Sybr Green 或 EB 染色液： （8）10X 上样缓冲液 （9）DNA 分子量标准物（DNA Marker） 四、操作步骤(Methods)
1.培养细菌( cultivation of bacteria) 将带有质粒的大肠杆菌于培养液中过夜培养 2.细菌中质粒DNA的快速提起( Rapid isolation of plasmid dNa From Bacteria) (1)取液体培养菌液1.5皿置小离心管中,10000r/min离心lmin去掉上清液。加 入150μL的溶液Ⅰ,充分混悬细菌,在室温下放置10mins (2)加入200μL新配置的溶液Ⅱ。加盖,颠倒5次使之混匀。冰上放置5min。 (3)加150μL冷却的溶液Ⅲ,加盖后颠倒5混匀,冰上放置15min。10000r/m 离心5min,上清液倒入另一离心管中 (4)向上清液中加入等体积苯酚/氯仿,震荡混匀,10000r/min离心2min,将上清 液转移至新的离心管中。 (5)向上清液中加入等体积无水乙醇,混匀,室温放置2min。离心5min,倒去上清 乙醇溶液,将离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体 (6)加lⅷ70%乙醇,震荡并离心,倒去上清液,晾干,加入20μL的T缓冲液,使 DNA完全溶解,待用。 3.质粒DNA的限制酶切( Restriction Digestion of Plasmid dnA) 取洁净消毒1.5m1离心管1支,分别加入下列成分: 自提样品质粒:10μL 10×酶切缓冲液:2μL 限制性内切酶:2~4 加双蒸水至总体积20μL,小心混匀,置于37℃水浴中,酶解1h,反应终止后 各酶切样品于冰箱中贮存备用 4.DNA琼脂糖凝胶电泳( Agarose Gel Electrophoresis of dNA) (1)琼脂糖凝胶的制备:称取0.4g琼脂糖,置于三角瓶中,加入50皿TAE缓冲液, 置微波炉加热全部融化后,取出摇匀,此为0.8%的琼脂糖凝胶 (2)琼脂糖凝胶板的制备:将胶模两端用胶带封闭,水平放置,插入上样梳。待琼脂 糖凝胶液将冷却至65℃左右时,小心倒入胶模中,使胶液缓慢展开,直到在整个玻璃板表
1．培养细菌(cultivation of bacteria) 将带有质粒的大肠杆菌于培养液中过夜培养 2．细菌中质粒 DNA 的快速提起（Rapid Isolation of Plasmid DNA From Bacteria） （1）取液体培养菌液 1.5 mL 置小离心管中，10 000r/min 离心 1min 去掉上清液。加 入 150μL 的溶液Ⅰ，充分混悬细菌，在室温下放置 10min。 （2）加入 200μL 新配置的溶液Ⅱ。加盖，颠倒 5 次使之混匀。冰上放置 5 min。 （3）加 150μL 冷却的溶液Ⅲ，加盖后颠倒 5 混匀，冰上放置 15 min。10 000r/min 离心 5 min，上清液倒入另一离心管中。 （4）向上清液中加入等体积苯酚/氯仿，震荡混匀，10 000r/min 离心 2 min，将上清 液转移至新的离心管中。 （5）向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室温放置 2 min。离心 5 min，倒去上清 乙醇溶液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 （6）加 1mL 70%乙醇，震荡并离心，倒去上清液，晾干，加入 20μL 的 TE 缓冲液，使 DNA 完全溶解，待用。 3． 质粒 DNA 的限制酶切(Restriction Digestion of Plasmid DNA) 取洁净消毒 1.5ml 离心管 1 支，分别加入下列成分： 自提样品质粒：10μL 10×酶切缓冲液：2μL 限制性内切酶：2～4 u 加双蒸水至总体积 20μL，小心混匀，置于 37℃水浴中，酶解 1h，反应终止后， 各酶切样品于冰箱中贮存备用。 4．DNA 琼脂糖凝胶电泳( Agarose Gel Electrophoresis of DNA) （1）琼脂糖凝胶的制备：称取 0.4g 琼脂糖，置于三角瓶中，加入 50 mL TAE 缓冲液， 置微波炉加热全部融化后，取出摇匀，此为 0.8%的琼脂糖凝胶。 （2）琼脂糖凝胶板的制备：将胶模两端用胶带封闭，水平放置，插入上样梳。待琼脂 糖凝胶液将冷却至 65℃左右时，小心倒入胶模中，使胶液缓慢展开，直到在整个玻璃板表
面形成均匀的胶层,室温下静置20min,待凝固完全后,轻轻拔出上样梳,在胶板上即形 成相互隔开的样品槽 (3)取3支1.5m1离心管,分别加入 DNA marker10μL、全部酶切DNA、未酶切的质 粒DNA5μL,再向各管中加入上样缓冲液2μL, Sybr green2 (4)加样:用微量加样器将上述3种样品分别加入凝胶样品小槽内。每次加完一个样 品,要用蒸馏水反复洗净微量加样器,以防止相互污染 (5)电泳 加完样品后的凝胶板,立即通电。样品进胶前,应使电流控制在20mA,样品进胶后电 压控制在60^80V,电流为40~50mA。当指示剂色带移动至距离胶板1~2cm处,停止电泳 (6)将电泳后的胶板在紫外检测仪下观察在琼脂糖凝胶中的DNA条带 五、结果观察(0 bservation of results 在波长为254mm的紫外灯下,观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出绿色的荧光条 带 六、思考题( Questions) 1.细菌染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么?
面形成均匀的胶层，室温下静置 20 min，待凝固完全后，轻轻拔出上样梳，在胶板上即形 成相互隔开的样品槽。 （3）取 3 支 1.5ml 离心管，分别加入 DNA marker 10μL、全部酶切 DNA、未酶切的质 粒 DNA5μL，再向各管中加入上样缓冲液 2μL，Sybr Green 2μL，混匀。 （4）加样：用微量加样器将上述 3 种样品分别加入凝胶样品小槽内。每次加完一个样 品，要用蒸馏水反复洗净微量加样器，以防止相互污染。 (5)电泳 加完样品后的凝胶板，立即通电。样品进胶前，应使电流控制在 20mA，样品进胶后电 压控制在 60~80V，电流为 40~50 mA。当指示剂色带移动至距离胶板 1～2cm 处，停止电泳。 (6) 将电泳后的胶板在紫外检测仪下观察在琼脂糖凝胶中的 DNA 条带。 五、结果观察(Observation of results) 在波长为 254nm 的紫外灯下，观察染色后的电泳胶板。DNA 存在处显示出绿色的荧光条 带。 六、思考题(Questions) 1．细菌染色体 DNA 与质粒 DNA 分离的主要依据是什么？
实验二PCR技术及应用 PCR Technique and Its Applications 目的 Ob jective) 掌握PCR基本原理和方法:熟悉PCR技术的应用。 二、原理( Principles) 聚合酶链式反应( Polymerase Chain Reaction,PCR)是体外酶促合成特异DNA片段 的一种方法,为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由模板高温变性、引物与模板 退火和引物链沿模板延伸三步反应组成一个循环,通过多次循环反应,使目的DNA得以迅 速扩增。其主要步骤是:将待扩增的模板DNA置高温下(通常为93℃-94℃)使其变性为 单链:人工合成的两个寡核苷酸引物(单链DNA)在其合适的复性温度下分别与待扩增模 板DNA的两条单链互补结合,两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短:耐热 的DNA聚合酶(Iaq酶)在2℃将单核苷酸从引物的3端开始掺入,按5→3方向延伸 合成与DNA模板互补的新链 PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段,并能轻易在50~100μL反应体 积中,对皮克(Pg)级含量的目的基因扩增得到微克级(μg)的特异性DNA片段。因此, PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的 分离、克隆和核苷酸序列分析,还可以用于突变体和重组体的构建,基因表达调控的研究, 基因多态性的分析,遗传病和传染病的诊断,肿瘤机制的探索,法医鉴定等诸多方面 三、主要设备、实验材料和试剂( Equipments, Mater ia Is and Agents) 1.主要设备( Equipments) (1)PCR仪 (2)台式高速离心机(16000r/min) (3)微量加样器10μL、100μL、1000μL各一支 (4)电泳仪、电泳槽 2.材料( Materials)
实验二 PCR 技术及应用 PCR Technique and Its Applications 一、 目的(Objective) 掌握 PCR 基本原理和方法；熟悉 PCR 技术的应用。 二、原理(Principles) 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异 DNA 片段 的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的 PCR 由模板高温变性、引物与模板 退火和引物链沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的 DNA 得以迅 速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板 DNA 置高温下（通常为 93℃-94℃）使其变性为 单链；人工合成的两个寡核苷酸引物（单链 DNA）在其合适的复性温度下分别与待扩增模 板 DNA 的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热 的 DNA 聚合酶（Taq 酶）在 72℃将单核苷酸从引物的 3’端开始掺入，按 5’→3’方向延伸， 合成与 DNA 模板互补的新链。 PCR 能快速特异扩增任何已知目的基因或 DNA 片段，并能轻易在 50～100μL 反应体 积中，对皮克（pg）级含量的目的基因扩增得到微克级（μg）的特异性 DNA 片段。因此， PCR 技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的 分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究， 基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。 三、 主要设备、实验材料和试剂（Equipments, Materials and Agents） 1．主要设备(Equipments) （1）PCR 仪 （2）台式高速离心机（16 000r/min） （3）微量加样器 10μL、100μL、1 000μL 各一支 （4）电泳仪、电泳槽 2．材料(Materials)
(1)薄壁反应管0.2mL×20 (2)塑料离心管架 (4)常用玻璃仪器及滴管等 3.试剂( Agents) (1)DNA模版 (2)对应目的基因的特异引物 (3)2 mM dNTPmⅸx:含dATP、dCTP、dGTP、dTIP各2mM (4)10× PCR Buffer (5) Taq dna聚合酶 (6)DNA染色试剂 Sybr Green 四、操作步骤 Methods) 1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10× PCr buffer 5 uI dNTP mix (2mM) 4 ul 引物1(1 Opol) 2 ul 引物2(10pmol) 2 ul Iaq聚合酶(2Uul) DNA模板(lng/u 加ddH2O至50μl,稍加离心混匀。视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油 2.设定反应程序,将上述混合液置PCR仪中进行扩增。扩增条件为93℃预变性2min,进 入循环扩增阶段:93℃30s→58℃30s→72℃30s,循环20-25次,最后在72℃保温 3.结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存 4.PCR的电泳检测:取10u扩增产物,加1μlDNA染色试剂 Syber Green,电泳检测 五、结果观察(0 bservation of resu lts) 在波长为254nm的紫外灯下,观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出绿色的荧光 条带。 六、注意事项( Cautions)
（1）薄壁反应管 0.2mL×20 （2）塑料离心管架×1 （4）常用玻璃仪器及滴管等 3．试剂(Agents) （1） DNA 模版 （2）对应目的基因的特异引物 （3）2mM dNTPmix：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM （4）10×PCR Buffer （5）Taq DNA 聚合酶 （6）DNA 染色试剂 Sybr Green 四、操作步骤(Methods) 1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌 0.5ml 离心管中。 10×PCR buffer 5 μl dNTP mix （2mM） 4 μl 引物 1（10pmol） 2 μl 引物 2（10pmol） 2 μl Taq 聚合酶 （2U/μl） 1 μl DNA 模板（1ng/μl） 1 μl 加 ddH2O 至 50 μl，稍加离心混匀。视 PCR 仪有无热盖，不加或添加石蜡油。 2．设定反应程序，将上述混合液置 PCR 仪中进行扩增。扩增条件为 93℃预变性 2min，进 入循环扩增阶段：93℃ 30s → 58℃ 30s → 72℃ 30s，循环 20－25 次，最后在 72℃ 保温 5min。 3． 结束反应，PCR 产物放置于 4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4．PCR 的电泳检测：取 10μl 扩增产物，加 1μl DNA 染色试剂 Syber Green，电泳检测。 五、结果观察(Observation of results) 在波长为 254nm 的紫外灯下，观察染色后的电泳胶板。DNA 存在处显示出绿色的荧光 条带。 六、注意事项(Cautions)
1.PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行 2.所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染,作过程中均应戴手套。 3.PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水,采用022um滤膜过滤除菌或高压灭菌 4.试剂都应该以大体积配制,试验一下是否满意,然后分装成仅够一次使用的量储存, 从而确保实验与实验之间的连续性。 5.试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿应洗涤干净并 高压灭菌。 6.PCR的样品应在冰浴上化开,并且要充分混匀 七、思考题〔 Questions) PCR扩增与细胞内DNA半保留复制有何异同?
１．PCR 反应应该在一个没有 DNA 污染的干净环境中进行。 2．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染，作过程中均应戴手套。 3．PCR 试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用 0.22μm 滤膜过滤除菌或高压灭菌。 4．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存， 从而确保实验与实验之间的连续性。 5．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并 高压灭菌。 6．PCR 的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。 七、思考题(Questions) 1、PCR 扩增与细胞内 DNA 半保留复制有何异同？