分子克隆工具酶及其应用
分子克隆工具酶及其应用
分子克隆工具酶及其应用 限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 ●核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 ●核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 ●核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 ●核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的未端修饰 其它酶类-用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯 化、检测等
分子克隆工具酶及其应用 ⚫ 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 ⚫ DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 ⚫ 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 ⚫ 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 ⚫ 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 ⚫ 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 ⚫ 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯 化、检测等
第一节 限制性内切核酸酶
第一节 限制性内切核酸酶
限制性内切酶的发现 1.细菌限制修饰系统的发现 Werner arber于1962-1968年发现,1968年分离到I 型限制酶。 2.限制酶HndI的发现 H.O. Smith和 Wilcox于1970年首次从流感嗜血 杆菌(H.i/mene)中发现并分离到Hind限制酶。 3.SV40限制图谱和转录图谱的绘制 D. Nathans(1971年)用Hind绘制Sv40的限制 酶谱
一 . 限制性内切酶的发现 1. 细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I 型限制酶。 2. 限制酶HindII的发现 H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血 杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。 3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制 D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制 酶谱
限制修饰系统的种类 1.I型:由三个基因构成,hsR;hslM;hss (host specificity for DNA restriction modification and specificity)位于染色体上, 个基因构成一个复合体,限制酶需要ATP、Mg2+ SAM(5—腺苷甲硫氨酸)。 2.Ⅱ型:限制与修饰基因产物独立起作用,在B cOl冲中这两种基因位于质粒上。 3.I型:修饰酶与I型酶相同,sM与hsdS基 因产物结合成一亚单位,限制酶是独立存在的 上述三个系统中,只有Ⅱ型限制酶与甲基化酶具 有相当高的核苷酸识别特异性,因而被广泛用于 基因工程中
二 . 限制修饰系统的种类 1. I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS （host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色体上，三 个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+ 、 SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。 2. II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ. coli中这两种基因位于质粒上。 3. III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基 因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具 有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于 基因工程中
限制性内切酶的定义、命名 1.定义:广义指上述三个系统中的限制酶; 狭义指Ⅱ型限制酶。 2.命名:限制酶由三部分构成,即菌种名、 菌系编号、分离顺序。 例如:HinⅢ前三个字母来自于菌种 名称H. influenzae,“d”表示菌系为d型 血清型;“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 EcoR-Escherichia coli RI Hindll-Haemophilus influensae d Ill Sac()--Streptomyces achromagenes I(n)
三. 限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、 菌系编号、分离顺序。 例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种 名称H. influenzae， “ｄ”表示菌系为ｄ型 血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
四.限制酶的特点 1.识别顺序和酶切位点 1)识别4-8个相连的核苷酸 Mbol NGATCN; Aval GG(AT)CC BamHI GGATCC: PpuMI PuG(A/T)Py noti gcggccgc: Sfil GGCCNNNNNGGCC CCGGNNNNNCCGG Fok I5-GGATG(N9-3 3- CCTAC(N)135外侧,产生5’端突 起 2)富含GC
四．限制酶的特点 1. 识别顺序和酶切位点 １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ) 9 -3’ 3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ) 13-5’ 外侧，产生５’-端突 起 ２）富含ＧＣ
3)对称性一双对称 ECORI5’-G4ATC3 3-CTTAAG-5 4)切点大多数在识别顺序之内,也有例外 5)限制酶切后产生两个末端,末端结构是 5-P和3’-0H 2.末端种类 1)3’端突起,个数为2或4个核苷酸 PstI5’- CTGCAG-3’5- CTGCA + G-3 3’- GACGTO-5 3-G ACGTC-5. 2)5’-端突起,个数为2或4个核苷酸 ECORI5’- GAATTO-3 5’-G AATTC-3 3-CTTAAG-5 3’- CTTAA G-5
３）对称性—双对称 EcoRI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’ ４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 ５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是 ５’-Ｐ和３’-ＯＨ 2. 末端种类 １）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸 Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA G-3’ 3’-GACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’ ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸 EcoRI 5’-GAATTC-3’ 5’-GOH PAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 3’-CTTAAP HOG-5’
3)平齐末端 Smal 5'-CCCGGG-32 5’-CCC GGG-3 3’- GGGCCO5 3-GGG + CCC-5' 4)非互补的粘性末端 a)切点在识别顺序之外的,如:FokI FokI5’- GGATO(No3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC(N)13-5 3 -CCTAC(N)13 b)能识别简并顺序的,如:Apl Aval 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG: CTCGGG: CCCGAG: CTCGAG
３） 平齐末端 SmaI 5’-CCCGGG-3’ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 3’-GGG CCC-5’ ４）非互补的粘性末端 ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5’-GGATG(Ｎ) 9 -3’ 5’-GGATG(N)9 3’-CCTAC(Ｎ) 13-5’ 3’-CCTAC(N)13 ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5’-CPyCGPuG-3’ CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG
5)相容性末端 如: BamBle GGATCC Bglll g AGATCT Mbol SauL ngaton 上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连,由此形成的重组 分子能被Mbo和Sm3A识别和酶切,但BmH和BI的识别机率 只有1/16。 BamhI +Mbol A/C/G/Tgatct/c/g/A BmH和Bg/ AGATCT两种酶产生的相容性末端,相连后不 能为两种酶所识别和酶切。 Bamhi Bglll A/G'GATCT/C 不同末端的连接特性:除第4种末端不能进行不同DNA分 子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外,其余生种 末端可以相互连接
５）相容性末端 如：BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI, Sau3AI N GATCN 上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组 分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率 只有1/16。 BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不 能为两种酶所识别和酶切。 BamHI + BglII A/G GATCT/C 不同末端的连接特性: 除第4种末端不能进行不同DNA分 子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种 末端可以相互连接