林病研究法实验指导书
林病研究法实验指导书
目录实验一标本的采集与制作实验二病原微生物培养基的制作和灭菌6实验三病原微生物的分离、纯化和培养12实验四普通光学显微镜的构造及使用方法16实验五显微镜测微尺的校准与使用22实验六病原菌孢子萌发实验..26实验七临时玻片的制作28实验八病原菌的接种实验31实验九质粒DNA的提取与酶切33
目录 实验一 标本的采集与制作.3 实验二 病原微生物培养基的制作和灭菌. 6 实验三 病原微生物的分离、纯化和培养.12 实验四 普通光学显微镜的构造及使用方法.16 实验五 显微镜测微尺的校准与使用.22 实验六 病原菌孢子萌发实验.26 实验七 临时玻片的制作.28 实验八 病原菌的接种实验.31 实验九 质粒 DNA 的提取与酶切.33
实验一标本的采集与制作林木病害标本是鉴定病害的依据，是科学研究的资料，又是陈列展览、宣传、教学用的形象用具，因此标本的采集和制作是一件重要的经常性的工作。标本制作的方法分为干燥法、浸渍法保存和微小的标本可制成玻片。制作和保存标本以能尽量保持原有性状为原则。干燥法简单而经济，应用也最广。一、目的通过采集和制作标本，了解植物病害标本采集的要求，学会标本的采集与记录，掌握植物病害标本的制作方法，进一步巩固病害知识，每人完成1份病害标本制作。二、原理室外采集标本是获取植物病害标本的重要途径，也是熟悉植物病害的症状，了解植物病害发病情况的最好方式。植物病害的发病时期与植物的生育期及当地的气候条件和生产条件有着密切的关系，所以在采集标本前应对某种植物病害的发病条件有着比较清楚的了解。首先，应明确在当地的气候条件和生产条件下，某种植物病害的始发期和盛发期；某种植物病害主要在植物的哪一个生育期间发病；以及某种植物病害主要发生在哪些植物上等等。标本的制作是为了日后能较为方便地观察植物病害的症状，并能及时提供研究的材料。稳妥的保存方法可为教学及相关的科研工作提供可靠的保障。无论用干燥制作法保存标本，还是用浸渍制作法保存标本，都是为了尽量减缓所保存标本变质的速度或不使其腐烂霉变。同时，也是为了尽量使标本保持其原色，以延长标本的使用时间和提高标本的保存质量。三、采集和制作标本用具采集夹、标本夹、标本纸、标本箱（筒）、剪刀、修枝剪、高枝剪、手锯手铲、纸袋、标签、手持放大镜及采集记录本、海拔仪等
实验一 标本的采集与制作 林木病害标本是鉴定病害的依据，是科学研究的资料，又是陈列展览、宣 传、教学用的形象用具，因此标本的采集和制作是一件重要的经常性的工作。 标本制作的方法分为干燥法、浸渍法保存和微小的标本可制成玻片。制作和保 存标本以能尽量保持原有性状为原则。干燥法简单而经济，应用也最广。 一、目的 通过采集和制作标本，了解植物病害标本采集的要求，学会标本的采集与 记录，掌握植物病害标本的制作方法，进一步巩固病害知识，每人完成 1 份病 害标本制作。 二、原理 室外采集标本是获取植物病害标本的重要途径，也是熟悉植物病害的症状， 了解植物病害发病情况的最好方式。植物病害的发病时期与植物的生育期及当 地的气候条件和生产条件有着密切的关系，所以在采集标本前应对某种植物病 害的发病条件有着比较清楚的了解。首先，应明确在当地的气候条件和生产条 件下，某种植物病害的始发期和盛发期；某种植物病害主要在植物的哪一个生 育期间发病；以及某种植物病害主要发生在哪些植物上等等。 标本的制作是为了日后能较为方便地观察植物病害的症状，并能及时提供 研究的材料。稳妥的保存方法可为教学及相关的科研工作提供可靠的保障。无 论用干燥制作法保存标本，还是用浸渍制作法保存标本，都是为了尽量减缓所 保存标本变质的速度或不使其腐烂霉变。同时，也是为了尽量使标本保持其原 色，以延长标本的使用时间和提高标本的保存质量。 三、采集和制作标本用具 采集夹、标本夹、标本纸、标本箱(筒)、剪刀、修枝剪、高枝剪、手锯、 手铲、纸袋、标签、手持放大镜及采集记录本、海拔仪等
四、实验操作病叶片、茎、果的采集和制作：可夹于吸水的标本纸或报纸中，用剪刀剪取病植物上的发病叶片。如杨树灰斑的病叶、杨树叶枯病的病叶、松落针病的病叶、白杨叶锈病的病叶、杨树灰斑病的病叶、丁香白粉病的病叶及梨黑星病的病叶等，装入采集夹中。尽量剪取整个一致的。用标本夹夹紧，数天即成。在压制过程中必须勤换干纸。高温高湿的天气，标本易发霉变色，更须勤换纸。通常前三四日每日换纸一二次以后每二三日换一次，至全部干燥为止。较大较大枝条和坚果采集和制作：挑取病害标本症状典型的采集，高等担子菌的革质或木质的子实体可直接晒干、烤干或风干或放入烘烤箱中以30-45℃烘干。肉质多水的病害标本采集和制作：制作伞菌或其他肉质菌标本：沿中心纵切成厚约1-1.5mm薄片（观察菌褶、菌柄二者关系），并把另一部分柄及挖去约1mm厚的菌盖（以观察色泽、外部形态）贴在涂有明胶液或万能胶的薄纸上，按标本形状将四周薄纸剪去，夹在吸水纸中压干，并勤换纸，干燥后贴在台纸上固定即成。一般情况下，各种病害的标本最好采集10份以上。在采集病斑类的叶片标本时，一个叶片上应只有一种类型的病斑。尤其是在各种病害混合发生时采集标本，更需进行仔细的选择；对于真菌病害，标本应带有子实体，无子实体在回到室内后，鉴定将非常困难。标本采集记录：采集时，要随时作标记。标签上一般应记录如下项目：寄主名称：俗名和学名都有时，应同时记下。采集时间：一般应记录年、月、日。采集地点：一般记录到省、市（县）即可，需要时也可记录到镇（乡）等。海拔高度：按海拔仪指示记录
四、实验操作 病叶片、茎、果的采集和制作： 可夹于吸水的标本纸或报纸中，用剪刀剪取病植物上的发病叶片。如杨树 灰斑的病叶、杨树叶枯病的病叶、松落针病的病叶、白杨叶锈病的病叶、杨树 灰斑病的病叶、丁香白粉病的病叶及梨黑星病的病叶等，装入采集夹中。尽量 剪取整个一致的。用标本夹夹紧，数天即成。在压制过程中必须勤换干纸。高 温高湿的天气，标本易发霉变色，更须勤换纸。通常前三四日每日换纸一二次， 以后每二三日换一次，至全部干燥为止。 较大较大枝条和坚果采集和制作： 挑取病害标本症状典型的采集，高等担子菌的革质或木质的子实体可直接 晒干、烤干或风干或放入烘烤箱中以 30-45℃烘干。 肉质多水的病害标本采集和制作： 制作伞菌或其他肉质菌标本：沿中心纵切成厚约 1-1.5mm 薄片（观察菌褶、 菌柄二者关系），并把另一部分柄及挖去约 1mm 厚的菌盖（以观察色泽、外部 形态）贴在涂有明胶液或万能胶的薄纸上，按标本形状将四周薄纸剪去，夹在 吸水纸中压干，并勤换纸，干燥后贴在台纸上固定即成。 一般情况下，各种病害的标本最好采集 10 份以上。在采集病斑类的叶片标 本时，一个叶片上应只有一种类型的病斑。尤其是在各种病害混合发生时采集 标本，更需进行仔细的选择；对于真菌病害，标本应带有子实体，无子实体在 回到室内后，鉴定将非常困难。 标本采集记录： 采集时，要随时作标记。标签上一般应记录如下项目： 寄主名称：俗名和学名都有时，应同时记下。 采集时间：一般应记录年、月、日。 采集地点：一般记录到省、市(县)即可，需要时也可记录到镇(乡)等。 海拔高度：按海拔仪指示记录
生态环境：按照山坡地、平坦地、沼泽地；砂质土、肥沃土等记录。采集序号：一般按照采集时间的先后顺序记录。采集人姓名：如实填写。提示：寄主名称如有不清楚的，能及时向当地人问明更好；如不能，应记下采集地的位置以及寄主的一些主要性状，以备鉴定时参考。必要时还应将寄主的花、果实以及其他部位标本一起采得，以便凭借寄主的标本对该寄主进行分类鉴定。森林病害标本采集记录卡片标本号采集地点生态环境（林分状况、立地条件）寄主名称（通用名及学名）危害部位标本性质（寄生或腐生）发病程度（发病率及散布程度）症状描述病名或学名鉴定人采集人附注五、实验报告1.请回答标本采集注意事项。2.整理并列出所采集标本类型，症状类型
生态环境：按照山坡地、平坦地、沼泽地；砂质土、肥沃土等记录。 采集序号：一般按照采集时间的先后顺序记录。 采集人姓名：如实填写。 提示：寄主名称如有不清楚的，能及时向当地人问明更好；如不能，应记 下采集地的位置以及寄主的一些主要性状，以备鉴定时参考。必要时还应 将寄主的花、果实以及其他部位标本一起采得，以便凭借寄主的标本对该 寄主进行分类鉴定。 五、实验报告 1. 请回答标本采集注意事项。 2. 整理并列出所采集标本类型，症状类型
实验二病原微生物培养基的制作和灭菌一、目的1、学习配制病原微生物培养基的一般方法和步骤。2、掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。二、原理正确掌握培养基的配制方法是从事病原微生物实验工作的重要基础。由于病原微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物的培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异，但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器血的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。三、实验材料1、药品：牛肉膏蛋白陈培养基、琼脂粉、1mol/L的NaOH和1mol/LHCI溶液。2、仪器及玻璃器血：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、酒精灯、移液管、试管、烧杯、量简、三角瓶、培养血和玻璃棒等。3、其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、报纸、线绳和注射器等。四、操作步骤（一）玻璃器皿的洗涤玻璃器血在使用前必须用洗涤剂洗刷干净，然后用自来水冲净，置于烘箱中烘干后备用。（二）牛肉膏蛋白陈培养基的配制
实验二 病原微生物培养基的制作和灭菌 一、目的 1、学习配制病原微生物培养基的一般方法和步骤。 2、掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。 二、原理 正确掌握培养基的配制方法是从事病原微生物实验工作的重要基础。由于 病原微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物的培养基的种类也 很多，它们的配方及配制方法虽各有差异，但一般培养基的配制程序却大致相 同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜 面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。 三、实验材料 1、药品：牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂粉、1mol/L 的 NaOH 和 1mol/L HCl 溶液。 2、仪器及玻璃器皿：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、酒精灯、 移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿和玻璃棒等。 3、其他物品：药匙、称量纸、pH 试纸、记号笔、棉花、报纸、线绳和注 射器等。 四、操作步骤 （一）玻璃器皿的洗涤 玻璃器皿在使用前必须用洗涤剂洗刷干净，然后用自来水冲净，置于烘箱 中烘干后备用。 （二）牛肉膏蛋白胨培养基的配制
1、培养基配制（1）称量：按培养基配方计算出各成分的用量，然后用电子天平进行准确称量后倒入一烧杯中。注意：称量药品时，一定要用称量纸而不能用滤纸。称药品用的药匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。（2）溶解：用量筒称量所需体积的水（根据实验需要可用自来水或蒸馏水），倒入烧杯中，用玻璃棒搅动溶解即可。（3）调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH，可用1mol/LNaOH或1mol/LHCI溶液进行调节。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用PH试纸测试，直至达到所需pH为止。注意：pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。2、制备液体培养基（1）用量简准确量取20ml培养基，倒入100ml三角瓶中，塞好棉塞，用报纸包好瓶口并用棉线包扎好，灭菌。注意：倒溶液时不要把瓶口沾湿。包扎时不要把瓶子弄倒而把棉塞弄湿。3、制备固体培养基（1）平板培养基A、用量筒准确量取100ml培养基，倒入250ml三角瓶中，加入2g琼脂粉，塞好棉塞，用报纸包好瓶口并用棉线包扎好，灭菌。B、将洗净烘干的培养血用报纸包扎好，灭菌。C、在超净工作台中，将装在三角瓶中已灭菌的琼脂培养基冷至50℃左右倾入无菌培养血中。温度过高时，血盖上的冷凝水太多；温度低于50℃，培养基易于凝固而无法制作平板。平板的制作应在火旁进行，左手拿培养血，右手拿三
1、培养基配制 （1）称量：按培养基配方计算出各成分的用量，然后用电子天平进行准确称量 后倒入一烧杯中。 注意：称量药品时，一定要用称量纸而不能用滤纸。称药品用的药匙不要 混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。 （2）溶解：用量筒称量所需体积的水（根据实验需要可用自来水或蒸馏水）， 倒入烧杯中，用玻璃棒搅动溶解即可。 （3）调 pH：一般用 pH 试纸测定培养基的 pH，可用 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCl 溶液进行调节。调节 pH 时，应逐滴加入 NaOH 或 HCI 溶液，防止局部过 酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用 PH 试纸测试，直至达 到所需 pH 为止。 注意：pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 2、制备液体培养基 （1）用量筒准确量取 20ml 培养基，倒入 100ml 三角瓶中，塞好棉塞，用报纸 包好瓶口并用棉线包扎好，灭菌。 注意：倒溶液时不要把瓶口沾湿。包扎时不要把瓶子弄倒而把棉塞弄湿。 3、制备固体培养基 （1）平板培养基 A、用量筒准确量取 100ml 培养基，倒入 250ml 三角瓶中，加入 2g 琼脂粉，塞 好棉塞，用报纸包好瓶口并用棉线包扎好，灭菌。 B、将洗净烘干的培养皿用报纸包扎好，灭菌。 C、在超净工作台中，将装在三角瓶中已灭菌的琼脂培养基冷至 50℃左右倾入 无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于 50℃，培养基易 于凝固而无法制作平板。平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿三
角瓶的底部，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养血盖打开，倾入10-15ml培养基，迅速盖好血盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平血中，冷凝后即成平板。（2）斜面培养基A、用量筒量取100ml培养基，倒入一个烧杯中，加入2g琼脂粉，置于石棉网上加热，用玻璃棒搅动溶解至琼脂粉溶解。B、将洗净烘干的试管放置在试管架上，用注射器将融化琼脂粉的培养基倒入试管至试管高度的1/4处。注意：不要将试管口弄脏。C、待培养基冷却凝固后，塞上棉塞，以2支或4支为一组，用报纸将试管口包扎好，灭菌。D、灭菌后，趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/2。10.无菌检查将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24-48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。（三）培养基的灭菌培养基经分装包扎后，应立即按配制方法规定的灭菌条件进行进行高压蒸汽灭菌。（四）培养基的灭菌检查灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好取出1-2管（瓶），置于37℃温箱中培养1-2天，确定无菌后方可使用。五、实验内容1、根据要求清洗各种玻璃器皿，并进行烘干和包扎。2、根据要求配制病原微生物培养基
角瓶的底部，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将 培养皿盖打开，倾入 10-15ml 培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平 皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。 （2）斜面培养基 A、用量筒量取 100ml 培养基，倒入一个烧杯中，加入 2g 琼脂粉，置于石棉网 上加热，用玻璃棒搅动溶解至琼脂粉溶解。 B、将洗净烘干的试管放置在试管架上，用注射器将融化琼脂粉的培养基倒入 试管至试管高度的 1/4 处。 注意：不要将试管口弄脏。 C、待培养基冷却凝固后，塞上棉塞，以 2 支或 4 支为一组，用报纸将试管口包 扎好，灭菌。 D、灭菌后，趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度 不超过试管总长的 1/2。 10．无菌检查 将灭菌的培养基放入 37℃温箱中培养 24-48h，无菌生长即可使用， 或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。 （三）培养基的灭菌 培养基经分装包扎后，应立即按配制方法规定的灭菌条件进行进行高压蒸 汽灭菌。 （四）培养基的灭菌检查 灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好取出 1-2 管（瓶），置于 37℃温箱中培养 1-2 天，确定无菌后方可使用。 五、实验内容 1、根据要求清洗各种玻璃器皿，并进行烘干和包扎。 2、根据要求配制病原微生物培养基
3、掌握用高压蒸汽灭菌锅对培养基灭菌。4、掌握液体培养基、平板培养基和斜面培养基的制备。六、实验报告（任选两题回答）1、记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。2、记录所做培养基的无菌检查结果。3、请用叙述一下PDA培养基的制作过程。附录-高压蒸汽灭菌技术一、目的要求了解消毒和灭菌的原理，并掌握各种灭菌方法的操作步骤。二、实验材料上述配制的培养基，包扎的培养血、试管，高压蒸汽灭菌锅，注射器，镊子，玻璃涂棒。三、基本原理在病原微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此必须对所用器材、培养基和工作场所进行灭菌和消毒。灭菌是指杀死一定环境中的所有微生物，包括微生物的营养体、芽孢和孢子。实验室常用的灭菌方法包括直接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸灭菌等方法。这些方法的基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的目的。四、操作步骤高压蒸汽灭菌是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，在一定的压力下保持15-30分钟进行灭菌。此法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅夹套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中排尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力
3、掌握用高压蒸汽灭菌锅对培养基灭菌。 4、掌握液体培养基、平板培养基和斜面培养基的制备。 六、实验报告（任选两题回答） 1、记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要 点。 2、记录所做培养基的无菌检查结果。 3、请用叙述一下 PDA 培养基的制作过程。 附录-高压蒸汽灭菌技术 一、目的要求 了解消毒和灭菌的原理，并掌握各种灭菌方法的操作步骤。 二、实验材料 上述配制的培养基，包扎的培养皿、试管，高压蒸汽灭菌锅，注射器，镊 子，玻璃涂棒。 三、基本原理 在病原微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此必须 对所用器材、培养基和工作场所进行灭菌和消毒。灭菌是指杀死一定环境中的 所有微生物，包括微生物的营养体、芽孢和孢子。实验室常用的灭菌方法包括 直接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸灭菌等方法。这 些方法的基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的 目的。 四、操作步骤 高压蒸汽灭菌是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，在一定的压力下保 持 15-30 分钟进行灭菌。此法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌， 也可用于玻璃器皿的灭菌。 将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅夹套 间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中排尽，然 后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力
从而使沸点增高，获得高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在相同的温度下，湿热灭菌的效果好于干热灭菌。有三点原因：1、在湿热灭菌中菌体吸收水分，蛋白质容易凝固变性，蛋白质随着含水量的增加，所需凝固温度降低：2、湿热灭菌中蒸汽的穿透力比干燥空气大；3、蒸汽在被灭菌物体表面凝结，释放出大量的汽化潜热，能迅速提高灭菌物体表面的温度，从而增加灭菌效力。实验室常用的灭菌锅有非自控手提式高压蒸汽灭菌锅和自控式灭菌锅，其结构和工作原理是相同的。本实验介绍的是半自控高压蒸汽灭菌锅，自控式灭菌锅的使用可参考厂家说明书。具体操作步骤如下：1、加水：首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面没过加热蛇管，与三角搁架相平为宜。切勿忘记检查水位，加水量过少，灭菌锅会发生烧干引起炸裂事故。2、装料：放回内层锅，并装入待灭菌的物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包扎的纸而透入棉塞。3、加盖：将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气，并打开排气阀。4、排气：打开电源加热灭菌锅，将水煮沸，使锅内的冷空气和水蒸汽一起从排气孔中排出。一般认为当排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内的空气已排尽，沸腾后约需3分钟。5、升压：冷空气完全排尽后，关闭排气阀，继续加热，锅内压力开始上升。6、保压：当压力表指针达到所需压力时，控制电源，开始计时并维持压力至所需的时间。如本实验中采用0.1Mpa，121.5℃，20分钟灭菌。注意：灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内的冷空气必须完全排尽后，才能关闭排气阀，维持所需压力。7、降压：达到灭菌所需的时间后，切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力表的压力降至“0”后，方可打开排气阀，排尽余下的蒸汽，旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品。压力一定要降到0"后，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会
从而使沸点增高，获得高于 100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭 菌的目的。 在相同的温度下，湿热灭菌的效果好于干热灭菌。有三点原因：1、在湿热 灭菌中菌体吸收水分，蛋白质容易凝固变性，蛋白质随着含水量的增加，所需 凝固温度降低；2、湿热灭菌中蒸汽的穿透力比干燥空气大；3、蒸汽在被灭菌 物体表面凝结，释放出大量的汽化潜热，能迅速提高灭菌物体表面的温度，从 而增加灭菌效力。 实验室常用的灭菌锅有非自控手提式高压蒸汽灭菌锅和自控式灭菌锅，其 结构和工作原理是相同的。本实验介绍的是半自控高压蒸汽灭菌锅，自控式灭 菌锅的使用可参考厂家说明书。具体操作步骤如下： 1、加水：首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面没过加热蛇 管，与三角搁架相平为宜。切勿忘记检查水位，加水量过少，灭菌锅会发生烧 干引起炸裂事故。 2、装料：放回内层锅，并装入待灭菌的物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸 汽流通而影响灭菌效果。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，三角瓶与 试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包扎的纸而透入棉塞。 3、加盖：将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内，摆正锅盖， 对齐螺口，然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使 漏气，并打开排气阀。 4、排气：打开电源加热灭菌锅，将水煮沸，使锅内的冷空气和水蒸汽一起从排 气孔中排出。一般认为当排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内的空气已排尽， 沸腾后约需 3 分钟。 5、升压：冷空气完全排尽后，关闭排气阀，继续加热，锅内压力开始上升。 6、保压：当压力表指针达到所需压力时，控制电源，开始计时并维持压力至所 需的时间。如本实验中采用 0.1Mpa，121.5℃，20 分钟灭菌。注意：灭菌的主 要因素是温度而不是压力，因此锅内的冷空气必须完全排尽后，才能关闭排气 阀，维持所需压力。 7、降压：达到灭菌所需的时间后，切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力 表的压力降至“0”后，方可打开排气阀，排尽余下的蒸汽，旋松螺栓，打开锅盖， 取出灭菌物品。压力一定要降到“0”后，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会