第三章蛋白质 第节 蛋白质论 蛋白质是所有生物中非常重要的结构分子和功能分子,几乎所有的生命现象和生物功能都是蛋白质作用的结果,因此, 蛋白质是现代生物技术,尤其是基因工程,蛋白质工程、酶工程等研究的重点和归宿点。 蛋白质的化学组成与分类 l、元素组成 碳50%氢。氧23%氮16%硫0-3%微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼 凯氏定氮:平均含氮16%,粗蛋白质含量=蛋白氮×625 2、氨基酸组成 从化学结构上看,蛋白质是由20种L型a氨基酸组成的长链分子。 3、分类 (1)、按组成: 简单蛋白:完全由氨基酸组成 结合蛋白:除蛋白外还有非蛋白成分(辅基) 详细分类,P75表3-1,表3-2。(注意辅基的组成)。 (2)、按分子外形的对称程度 球状蛋白质:分子对称,外形接近球状,溶解度好,能结晶,大多数蛋白质属此类。 纤维状蛋白质:对称性差,分子类似细棒或纤维状。 (3)、功能分 酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。 4、蛋白质在生物体内的分布 含量干重)微生物50-80% 人体45% 一般细胞50% 种类大肠杆菌3000种 人体10万种 生物界10 蛋白质分子大小与分子量 蛋白质是由20种基本aa组成的多聚物,a数目由几个到成百上千个,分子量从几千到几千万。一般情况下,少于50
１ 第三章 蛋白质 第一节 蛋白质概论 蛋白质是所有生物中非常重要的结构分子和功能分子，几乎所有的生命现象和生物功能都是蛋白质作用的结果，因此， 蛋白质是现代生物技术，尤其是基因工程，蛋白质工程、酶工程等研究的重点和归宿点。 一、 蛋白质的化学组成与分类 1、元素组成 碳 50% 氢 7% 氧 23% 氮 16% 硫 0-3% 微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼 凯氏定氮：平均含氮16%，粗蛋白质含量=蛋白氮×6.25 2、氨基酸组成 从化学结构上看，蛋白质是由20 种L-型α氨基酸组成的长链分子。 3、分类 （1）、 按组成： 简单蛋白：完全由氨基酸组成 结合蛋白：除蛋白外还有非蛋白成分（辅基） 详细分类，P 75 表 3-1，表 3-2。（注意辅基的组成）。 （2）、 按分子外形的对称程度： 球状蛋白质：分子对称，外形接近球状，溶解度好，能结晶，大多数蛋白质属此类。 纤维状蛋白质：对称性差，分子类似细棒或纤维状。 （3）、 功能分： 酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。 4、蛋白质在生物体内的分布 含量(干重) 微生物 50-80% 人 体 45% 一般细胞 50% 种类 大肠杆菌 3000 种 人体 10 万种 生物界 1010 -1012 二、 蛋白质分子大小与分子量 蛋白质是由20种基本aa组成的多聚物，aa数目由几个到成百上千个，分子量从几千到几千万。一般情况下，少于50
个a的低分子量a多聚物称为肽,寡肽或生物活性肽,有时也罕称多肽。多于50个a的称为蛋白质。但有时也把含有 条肽链的蛋白质不严谨地称为多肽。此时,多肽一词着重于结构意义,而蛋白质原则强调了其功能意义。 P76表3-3(注意:单体蛋白、寡聚蛋白;残基数、肽链数。) 蛋白质分子量=aa数目*110 对于任一给定的蛋白质,它的所有分子在氨基酸组成、顺序、肽链长度、分子量等方面都是相同的,均一性。 、蛋白质分子的构象与结构层次 蛋白质分子是由氨基酸首尾连接而成的共价多肽链,每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构,这种空间结构称为 蛋白质的(天然)构象 P77图3-1,蛋白质分子的构象示意图 一级结构氨基酸顺序 二级结构α螺旋、β折叠、β转角,无规 三级结构α螺旋、β折叠、β转角、松散 四级结构多亚基聚集 四、蛋白质功能的多样性 细胞中含量最丰实、功能最多的生物大分子 1.酶 2.结构成分(结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白) 3.贮藏(卵清蛋白、种子蛋白) 4.物质运输(血红蛋白、Na-K- ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体) 5.细胞运动(肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白) 6.激素功能(胰岛素) 7.防御(抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白) 8.接受、传递信息(受体蛋白,味觉蛋白) 9.调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达(组蛋白、阻遏蛋白) 第二节 氨基酸 蛋白质的水解见P79 氨基酸是蛋白质的基本结构单位。在酸、碱、蛋白酶的作用下,可以被水解成氨基酸单体。 酸水解:色氨酸破坏,天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基 碱水解:消旋,色氨酸稳定 酶水解:水解位点特异,用于级结构分析,肽谱氨基酸的功能: (1)、组成蛋白质 (2)、一些aa及其衍生物充当化学信号分子 y-amino butyric acid(氨基丁酸、 Serotonin(5羟色胺,血清紧张素)、 melaton(褪黑激素,N乙酰甲氧基色胺),都是
２ 个 aa的低分子量aa多聚物称为肽，寡肽或生物活性肽，有时也罕称多肽。多于50个aa的称为蛋白质。但有时也把含有一 条肽链的蛋白质不严谨地称为多肽。此时，多肽一词着重于结构意义，而蛋白质原则强调了其功能意义。 P 76 表 3-3 （注意：单体蛋白、寡聚蛋白；残基数、肽链数。） 蛋白质分子量= aa数目*110 对于任一给定的蛋白质，它的所有分子在氨基酸组成、顺序、肽链长度、分子量等方面都是相同的，均一性。 三、 蛋白质分子的构象与结构层次 蛋白质分子是由氨基酸首尾连接而成的共价多肽链，每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构，这种空间结构称为 蛋白质的（天然）构象。 P77 图 3-1，蛋白质分子的构象示意图。 一级结构 氨基酸顺序 二级结构 α螺旋、β折叠、β转角，无规卷曲 三级结构 α螺旋、β折叠、β转角、松散肽段 四级结构 多亚基聚集 四、 蛋白质功能的多样性 细胞中含量最丰实、功能最多的生物大分子。 1． 酶 2． 结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白） 3． 贮藏（卵清蛋白、种子蛋白） 4． 物质运输（血红蛋白、Na+ -K+ -ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体） 5． 细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白） 6． 激素功能（胰岛素） 7． 防御（抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白） 8． 接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白） 9． 调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白） 第二节 氨基酸 一、 蛋白质的水解(见P79) 氨基酸是蛋白质的基本结构单位。在酸、碱、蛋白酶的作用下，可以被水解成氨基酸单体。 酸水解：色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基 碱水解：消旋，色氨酸稳定 酶水解：水解位点特异，用于一级结构分析，肽谱氨基酸的功能： （1）、 组成蛋白质 （2）、 一些 aa及其衍生物充当化学信号分子 -amino butyric acid (-氨基丁酸)、Serotonic(5-羟色胺，血清紧张素)、melatonin(褪黑激素，N-乙酰-甲氧基色胺)，都是
神经递质,后二者是色氨酸衍生物神经递质是一个神经细胞产生的影响第二个神经细胞或肌肉细孢功能的物质)。 Thyroxine(甲状腺素,动物甲状腺 thyroid gland产生的Tr衍生物和吲乙酸(植物中的Tp衍生物都是激素激素就是一 个细胞产生的调节其它细胞的功能的化学信号分子)。 (3)、氨基酸是许多含N分子的前体物 核苷酸和核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都霈要a 些基本基酸和非基本a是代谢中闻物 精氨酸、iu山in(瓜氨酸)、 Omithine(鸟氨酸)是尿素循不( Urea cycle的中间物,含氮废物在脊椎动物肝脏中合成尿素是」 排除它们的一种重要机制。 氨基酸的结构与分类 l809年发现Asp,1938年发Th,目前己发现180多种。但是组成蛋白质的aa常见的有20种,称为基本氨基酸(编 码的蛋白质氨基酸),还有一些称为稀有氨基酸,是多肽合成后由基本a经酶促修饰而来。此外还有存在于生物体内但不 组成蛋白质的非蛋白质氨基酸约150种 编码的蛋白质氨基酸(20种) 也称基本氨基酸或标准氨基酸,有对应的遗传密码。 近年发现谷胱甘肽过氧化物酶中存在硒代半胱氨酸,有证据表明此氨基酸由终止密码UGA编码,可能是第21种蛋白 质氨基酸。 结构通式 不变部分,可变部分。L型,羧酸的α-碳上接NH,所以都是L-α-氨基酸。 a-氨基酸都是白色晶体,熔点一般在200℃以上 除胱氨酸和酪氨酸外都能溶于水,脯氨酸和羟脯氨酸丕能溶于乙醇和乙醚。 表20种氨基酸结构 l、按照R基的化学结构分(蛋白质工程的同源替代) (1)、R为脂肪烃基的氨基酸(5种 Gly、Aa、Val、Leu、lle 图3-2 R基均为中性烷基(G↓为H),R基对分子酸碱性影响很小,它们几乎有相同的等电点。(60±003) P92表3-7(比较等电点。) Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸,因此不具旋光性 从G至le,R基团疏水性增加,le是这20种aa中脂溶性最强的之一(除Phe25、Tp34、Tr23以外)
３ 神经递质，后二者是色氨酸衍生物(神经递质是一个神经细胞产生的影响第二个神经细胞或肌肉细胞功能的物质)。 Thyroxine(甲状腺素，动物甲状腺thyroid gland产生的 Tyr 衍生物)和吲乙酸(植物中的Trp衍生物)都是激素(激素就是一 个细胞产生的调节其它细胞的功能的化学信号分子)。 （3）、 氨基酸是许多含N分子的前体物 核苷酸和核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都需要aa （4）、 一些基本氨基酸和非基本aa是代谢中间物 精氨酸、Citrulline(瓜氨酸)、Ornithine(鸟氨酸)是尿素循不(Urea cycle)的中间物，含氮废物在脊椎动物肝脏中合成尿素是 排除它们的一种重要机制。 三、 氨基酸的结构与分类 1809 年发现 Asp，1938 年发 Thr，目前已发现 180 多种。但是组成蛋白质的 aa 常见的有 20 种，称为基本氨基酸（编 码的蛋白质氨基酸），还有一些称为稀有氨基酸，是多肽合成后由基本 aa 经酶促修饰而来。此外还有存在于生物体内但不 组成蛋白质的非蛋白质氨基酸(约150 种)。 （一） 编码的蛋白质氨基酸（20种） 也称基本氨基酸或标准氨基酸，有对应的遗传密码。 近年发现谷胱甘肽过氧化物酶中存在硒代半胱氨酸，有证据表明此氨基酸由终止密码UGA编码，可能是第21种蛋白 质氨基酸。 结构通式： 不变部分，可变部分。L-型，羧酸的α-碳上接-NH2，，所以都是L-α-氨基酸。 α-氨基酸都是白色晶体，熔点一般在200℃以上。 除胱氨酸和酪氨酸外都能溶于水，脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇和乙醚。 表 20 种氨基酸结构 1、按照 R基的化学结构分（蛋白质工程的同源替代）： （1）、 R 为脂肪烃基的氨基酸（5种） Gly、Ala、Val、Leu、Ile、 图 3-2 R 基均为中性烷基（Gly 为H），R 基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。（6 .0±0.03） P 92 表 3-7 （比较等电点。） Gly 是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。 从 Gly 至Ile，R 基团疏水性增加，Ile 是这 20 种 a.a 中脂溶性最强的之一（除Phe 2.5、Trp3.4 、Tyr 2.3 以外）
(2) R中含有羟基和碗的基酸(共4种) 含羟基的有两种:Sc和Thr 图3-3 Sr的〔HOH基(pK=15),在生理条件下不解离,但它是一个极性基团,能与其它基团形成氢键,具有重要的生理 意义。在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。 Ihr中的-OH是仲醇,具有亲水性,但此OH形成氢键的能力较弱,因此,在蛋白质活性中心中很少出现 Ser和Thr的OH往往与糖链相连,形成糖蛋白。 含硫的两种:Cys、Met 图3 Cys中R含巯基(SH),Cys具有两个重要性质 (1)在较高pH值条件,巯基离解。 (2)两个Cys的巯基氧化生成二硫键,生成胱氨酸。 Cys-s Cys 二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义。 Cys还常常出现在酶的活性中心。 Met的R中含有甲硫基(-SCH3),硫原子有亲核性,易发生极化,因此,Me是一种重要的甲基供体。 ◆Cys与结石 在细胞外液如血液中,Cys以胱氨酸 Cystine)氧化形式存在,胱氨酸的溶解性最差 胱氨酸尿( stenura)是一种遗传病,由于胱氨酸的跨膜运输缺陷导致大量的胱氨酸排泄到尿中。胱氨酸在腎( Kidney)、 输尿管( ureter、膀胱( urinary bladder)中结晶形成结石( Calculus. calculi),结石会导致疼疼、发炎甚至尿血 大量服用青霉胺rPeη nicillcemine)能降低肾中咣胱氨的含量,因为青霉胺与半胱氨酸形成的化合物比胱氨酸易溶解。 青霉胺的结构 (3)、R中含有酰胺基团(2种) Asn、Gln 图3-5 酰胺基中氨基易发生氨基转移反应,转氨基反应在生物合成和代谢中有重要意义 (4)、R中含有酸性基团(2种) Asp、Gu,般称酸性氨基酸 图3-6 Asp侧链羧基pKa(B-COOH)为386,Gu侧链羧基pKa(Y-COOH)为425 它们是在生理条件下带有负电荷的仅有的两个氨基酸 (5)、R中含碱性基团(3种) Lys、Arg、Hs,一般称碱性氨基酸 图3-7 Lys的R侧链上含有一个氨基,侧链氨基的pka为10.53。生理条件下,Iys侧链带有一个正电荷(-NH+),同时它 的侧链有4个C的直链,柔性较大,使侧链的氨基反应活性增大。(如肽聚糖的短肽间的连接) Arg是碱性最强的氨基酸,侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱,pKa值为1248,生理条件下完全质子化。 Hi含咪唑环,咪唑琍的p在游离氨基酸中和在多肽链中不同,前者pa为600,后者为735,它是20种氨基酸中 侧链pKa值最接近生理pH值的一种,在接近中性pH时,可离解平衡。它是在生理pl条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸 His含咪唑环,一侧去质子化和另一侧质子化同步进行,因而在酶的酸碱催化机制中起重要作用。 (6)、R中含有芳基的氨基酸(3种)
４ （2）、 R 中含有羟基和硫的氨基酸（共4种） 含羟基的有两种：Ser 和Thr。 图 3-3 Ser 的-CH2 OH基（pKa=15），在生理条件下不解离，但它是一个极性基团，能与其它基团形成氢键，具有重要的生理 意义。在大多数酶的活性中心都发现有Ser 残基存在。 Thr 中的-OH是仲醇，具有亲水性，但此-OH形成氢键的能力较弱，因此，在蛋白质活性中心中很少出现。 Ser 和 Thr 的-OH 往往与糖链相连，形成糖蛋白。 含硫的两种：Cys、Met 图 3-4 Cys 中 R 含巯基（-SH），Cys 具有两个重要性质： （1）在较高pH值条件，巯基离解。 （2）两个Cys 的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。 Cys—s—s—Cys 二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义。 Cys 还常常出现在酶的活性中心。 Met 的 R 中含有甲硫基（-SCH3），硫原子有亲核性，易发生极化，因此，Met是一种重要的甲基供体。 ◆ Cys 与结石 在细胞外液如血液中，Cys 以胱氨酸(Cystine)氧化形式存在，胱氨酸的溶解性最差。 胱氨酸尿(Cystinuria)是一种遗传病，由于胱氨酸的跨膜运输缺陷导致大量的胱氨酸排泄到尿中。胱氨酸在肾(Kidney)、 输尿管(ureter)、膀胱(urinary bladder)中结晶形成结石(Calculus, calculi)，结石会导致疼疼、发炎甚至尿血。 大量服用青霉胺(Penicillcemine)能降低肾中胱氨的含量，因为青霉胺与半胱氨酸形成的化合物比胱氨酸易溶解。 青霉胺的结构 （3）、 R 中含有酰胺基团（2种） Asn、Gln 图 3-5 酰胺基中氨基易发生氨基转移反应，转氨基反应在生物合成和代谢中有重要意义 （4）、 R 中含有酸性基团（2种） Asp、Glu，一般称酸性氨基酸 图 3-6 Asp 侧链羧基pKa（β-COOH）为3.86，Glu 侧链羧基pKa（γ-COOH）为4.25 它们是在生理条件下带有负电荷的仅有的两个氨基酸。 （5）、 R 中含碱性基团（3种） Lys、Arg、His，一般称碱性氨基酸 图 3-7 Lys 的 R侧链上含有一个氨基，侧链氨基的pKa为10.53。生理条件下，Lys侧链带有一个正电荷（—NH3 +），同时它 的侧链有4 个C 的直链，柔性较大，使侧链的氨基反应活性增大。（如肽聚糖的短肽间的连接） Arg 是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，pKa 值为12.48，生理条件下完全质子化。 His 含咪唑环，咪唑环的 pKa在游离氨基酸中和在多肽链中不同，前者 pKa为 6.00，后者为 7.35，它是 20 种氨基酸中 侧链pKa值最接近生理pH值的一种，在接近中性pH时，可离解平衡。它是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。 His 含咪唑环，一侧去质子化和另一侧质子化同步进行，因而在酶的酸碱催化机制中起重要作用。 （6）、 R 中含有芳基的氨基酸（3种）
Phe、Try、Ti 图3-8 都具有共轭π电子体系易与其它缺电子体系或π电子体系形成电荷转移复合物( charge- transfer complex或电子重叠 复合物。在受体一底物、或分子相互识别过程中具有重要作用 这三种氨基酸在紫外区有特殊吸收峰,蛋白质的紫外吸收主要来自这三种氨基酸,在280m处,Tp>Ir>Phe Phe疏水性最强。 酪氨酸的OH磷酸化是一个十分普遍的调控机制,τyr在较高pH值时,酚羟基离解 Trp有复杂的π共轭休系,比Phe和Tyr更易形城电荷转移络合物 (7)、R为环状的氨基酸(1种) Pro,有时也把Hs、Tp归入此类。 图3-9 Pro是唯一的一种环状结构的氨基酸,它的α-亚氨基是环的一部分,因此具有特殊的刚性结构。它在蛋白质空间结构 中具有极重要的作用,一般出现在两段α螺旋之间的转角处,Po残基所在的位置必然发生骨架方向的变化, ◆必需氨基酸: 成年人:Leu、le、Ⅷ、Thr、Mt、Tm、Lys、Ph 婴儿期:Arg和Hls供给不足,属半必须氨基酸 必须氨基酸在人体内不能合成,是由于人体内不能合成这些氨基酸的碳架(α酮酸) 2、按照R基的极性性质能否与水形成氢键20种基本a,可以分为4类 侧链极性(疏水性程度) Gu-25 Ala 05 Asn -2.5 Arg-3.0 M 1.3 His.5 Pro Thr 0.4 Leu 1.8 2.3 phe (1 非极性安基酸 9种,包括:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸氨酸、脯氨酸,这类氨基酸 的R基都是疏水性的,在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用 不带电何的极性氨基酸 6种,丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键,因此很容 易溶于水。 酪氨酸的OH磷酸化是一个十分普遍的调控机制,Ser和Thr的OH往往与糖链相连,Asn和Gn的-NH2很容易形城成 氢键,因此能增加蛋白质的稳定性 (3)、带负电荷的a酸性a) 2种,在pH6-7时,谷氨酸和天冬氨酸的第二个羧基解离,因此,带负电何
５ Phe、Try、Trp 图 3-8 都具有共轭π电子体系,易与其它缺电子体系或π电子体系形成电荷转移复合物( charge-transfer complex)或电子重叠 复合物。在受体—底物、或分子相互识别过程中具有重要作用。 这三种氨基酸在紫外区有特殊吸收峰，蛋白质的紫外吸收主要来自这三种氨基酸，在280nm 处，Trp＞Tyr＞Phe。 Phe 疏水性最强.。 酪氨酸的-OH磷酸化是一个十分普遍的调控机制，Tyr 在较高pH值时，酚羟基离解。 Trp 有复杂的π共轭休系，比Phe和Tyr 更易形成电荷转移络合物。 （7）、 R 为环状的氨基酸（1种） Pro，有时也把His、Trp归入此类。 图 3-9 Pro 是唯一的一种环状结构的氨基酸，它的α-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。它在蛋白质空间结构 中具有极重要的作用，一般出现在两段α-螺旋之间的转角处，Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化， ◆ 必需氨基酸： 成年人：Leu、Ile、Val、Thr、Met、Trp、Lys、Phe 婴儿期：Arg 和His 供给不足，属半必须氨基酸。 必须氨基酸在人体内不能合成，是由于人体内不能合成这些氨基酸的碳架（α-酮酸） 2、按照 R基的极性性质(能否与水形成氢键)20种基本aa，可以分为4类： 侧链极性(疏水性程度) Gly 0 Ser -0.3 Glu -2.5 Lys -3.0 Ala 0.5 Asn -0.2 Asp -2.5 Arg -3.0 Met 1.3 Gln -0.2 His 0.5 Pro 1.4 Thr 0.4 Val 1.5 Cys 1.0 Leu 1.8 Tyr 2.3 Ile 1.8 Phe 2.5 Trp 3.4 （1）、 非极性氨基酸 9 种，包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸氨酸、脯氨酸，这类氨基酸 的 R 基都是疏水性的，在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用。 （2）、 不带电何的极性氨基酸 6 种，丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容 易溶于水。 酪氨酸的-OH 磷酸化是一个十分普遍的调控机制，Ser 和 Thr 的-OH 往往与糖链相连，Asn 和 Gln 的-NH2很容易形成 氢键，因此能增加蛋白质的稳定性。 （3）、 带负电荷的aa(酸性aa) 2 种，在pH6~7 时，谷氨酸和天冬氨酸的第二个羧基解离，因此，带负电何
(4)、带正电何的aa(碱性aa) 3种,Amg、Lys、Hs在pH7时带净正电荷。 当胶原蛋白中的Iys侧链氧化时能形成很强的分子间内)交联。Arg的胚基碱性很强,与№aOH相当。His是一个弱碱, 在pH7时约10%质子化,是天然的缓冲剂,它往往存在于许多酶的活性中心。 酶的活性中心:Hi、Ser、Cs 非极性a一般位于蛋白质的硫琉水核心,带电荷的a和极性a位于表面。 非编码的白质氨基 也称修饰氨基酸,是在蛋白质合成后,由基本氨基酸修饰而来。 thrombin(凝血酶原中含有γ羧基谷氨酸,能结合Ca2 结缔组织中最丰富的蛋白质胶原蛋白含有大量4-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸。 图3-10修饰a的结构 (1)4羟脯氨酸 (2)5羟赖氨酸 这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白(如胶原蛋白)中。 (3)6N-甲基赖氨酸(存在于肌球蛋白中) (4)r-羧基谷氨酸 存在于凝血酶原及某些具有结合Ca离子功能的蛋白质中。 (5)Iyr的衍生物:3.5·碘酪氨酸、甲状腺素(甲状腺蛋白中) (6)锁链素由4个Lys组成(弹性蛋白中) 非蛋白质氨基酸 除参与蛋白质组成的20多种氨基酸外,生物体内存在大量的氨基酸中间代谢产物,它们不是蛋白质的结构单元,但在 生物体内具有很多生物学功能,如尿素循环中的L-瓜氨酸和L-鸟氨酸 (1)L型α-氨基酸的衍生物 L瓜氨酸 图 图 (2)D型氨基酸 D-Glu、DAla(肽聚糖中)、DPhe(短杆菌肽S) (3)β-、 氨基酸 β-Ala(泛素的前体)γ氨基丁酸(裨经递质)。 四、氨基酸的构型、旋光性和光吸收 l、氨基酸的构型 除(y外,19种氨基酸的α-碳原子都是不对称碳原子,因此有两种光学异构体,而Th和le的β-碳原子也是不对称 的,因此Thr、le各有两个不对称碳原子,有四种光学异构体
６ （4）、 带正电何的aa(碱性aa) 3 种，Arg、Lys、His。在pH7 时带净正电荷。 当胶原蛋白中的Lys侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联。Arg的胚基碱性很强，与NaOH相当。His是一个弱碱， 在 pH7 时约10%质子化，是天然的缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。 酶的活性中心：His、Ser、Cys 非极性 aa 一般位于蛋白质的疏水核心，带电荷的aa 和极性aa 位于表面。 （二） 非编码的蛋白质氨基酸 也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。 Prothrombin(凝血酶原)中含有-羧基谷氨酸，能结合Ca2+。 结缔组织中最丰富的蛋白质胶原蛋白含有大量4-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸。 图 3-10 修饰 aa 的结构 （1）4-羟脯氨酸 （2）5-羟赖氨酸 这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白（如胶原蛋白）中。 （3）6-N-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中） (4)г-羧基谷氨酸 存在于凝血酶原及某些具有结合Ca 2+离子功能的蛋白质中。 （5）Tyr的衍生物： 3.5 -二碘酪氨酸、甲状腺素 （甲状腺蛋白中） （6）锁链素由4 个Lys组成（弹性蛋白中）。 （三） 非蛋白质氨基酸 除参与蛋白质组成的20多种氨基酸外，生物体内存在大量的氨基酸中间代谢产物，它们不是蛋白质的结构单元，但在 生物体内具有很多生物学功能，如尿素循环中的L-瓜氨酸和L-鸟氨酸。 （1）L-型α –氨基酸的衍生物 L-瓜氨酸 图 L-鸟氨酸 图 （2）D-型氨基酸 D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S） （3）β-、γ-、δ-氨基酸 β-Ala（泛素的前体）、γ-氨基丁酸（神经递质）。 四、 氨基酸的构型、旋光性和光吸收 1、氨基酸的构型 除 Gly外，19种氨基酸的α-碳原子都是不对称碳原子，因此有两种光学异构体，而Thr 和Ile的β-碳原子也是不对称 的，因此Thr、Ile 各有两个不对称碳原子，有四种光学异构体
图P86L苏氨酸D-苏氨酸L别一苏D-别-苏 构成蛋白质的氨基酸均属L型(L-苏氨酸),大部分游离氨基酸也是L型。 2、旋光性 20种氨基酸中,只有Gy无手性碳。Thr、le各有两个手性碳。其余17种氨基酸L型与D型互为镜象关系,互称 光学异构体(对映体,或立体异构体)。一个异构体的溶液可使偏振光逆时针旋转(记为(一)。另一个异构体可使偏振光 顺时针旋转(计为(+),称为旋光性。 光学异构体的其它理化性质完全相同。 外消旋物D型和L-型的等摩尔混合物 L-苏氨酸和D苏氨酸、L别一苏氨酸和D别苏氨酸分别组成消旋物,而L(D)苏氨酸和L(D)别一苏氨酸则是 非对映体 旋光性物质在化学反应时经过对称的过度态时会发生消旋现象。蛋白质在与碱共热水解时或用一般的化学方法人工合 成氨基酸时也会得到无旋光性的D、L-消旋物 内消旋物分子内消旋 胱氨酸有三种立体异构体:L-胱氨酸、D胱氨酸、内消旋胱氨酸。 L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物 P86 L-胱氨酸 D-胱氨酸内消旋胱氨酸:(分子内部互相抵消而无旋光性) 蛋白质中L型基酸的比旋)度 P87蛋白质中L型氨基酸的比旋光度 氨基酸的旋光符号和大小取决于它的R基的性质,并与溶液的PH值有关(PH值影响氨基和羧基的解离)。 3、氨基酸的光吸收性 220种氨基酸在可见光区域无光吸收,在远紫外区(20m0均有光吸收,在近紫外区(2030m)只有下r、Ph 有吸收 Iyr、Phe、Tp的R基含有共轭双键,在220-300m紫外区有吸收 275 14×103 Phe 257 2.0×10 280 56×10 Lambert-Beer A=-g=l=E.c·L 五、氨基酸的酸碱性质(重点) l、氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性高子形式存在 α-氨基酸都含有-OOH和N,都是不挥发的结晶固体,熔点200350℃,不溶于非极性溶剂,而易溶于水,这些 性质与典型的羧酸( R-COOH)或胺(RNH)明显不同。 三个现象: ①晶体溶点高→离子晶格,不是分子晶格。 ②不溶于非极性溶剂→极性分子 ③介电常数高(氨基酸使水的介电常数增高,而乙醇、丙酮使水的介电常数降低。)→水溶液中的氨基酸是极性分子 7
７ 图 P86 L-苏氨酸 D-苏氨酸 L-别一苏 D-别-苏 构成蛋白质的氨基酸均属L-型（L-苏氨酸），大部分游离氨基酸也是L-型。 2、旋光性 20 种氨基酸中，只有 Gly 无手性碳。Thr、Ile 各有两个手性碳。其余 17 种氨基酸的 L 型与 D 型互为镜象关系，互称 光学异构体（对映体，或立体异构体）。一个异构体的溶液可使偏振光逆时针旋转（记为（一））。另一个异构体可使偏振光 顺时针旋转（计为（+）），称为旋光性。 光学异构体的其它理化性质完全相同。 外消旋物：D-型和L-型的等摩尔混合物。 L-苏氨酸和D-苏氨酸、L-别一苏氨酸和D-别-苏氨酸分别组成消旋物，而L-（D-）苏氨酸和L-（D-）别一苏氨酸则是 非对映体。 旋光性物质在化学反应时经过对称的过度态时会发生消旋现象。蛋白质在与碱共热水解时或用一般的化学方法人工合 成氨基酸时也会得到无旋光性的D-、L-消旋物。。 内消旋物：分子内消旋 胱氨酸有三种立体异构体：L-胱氨酸、D-胱氨酸、内消旋胱氨酸。 L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物 图 P86 L-胱氨酸 D-胱氨酸 内消旋胱氨酸：（分子内部互相抵消而无旋光性） 蛋白质中L型氨基酸的比旋光度 P 87 蛋白质中L 型氨基酸的比旋光度。 氨基酸的旋光符号和大小取决于它的R 基的性质，并与溶液的PH 值有关（PH 值影响氨基和羧基的解离）。 3、氨基酸的光吸收性 20种氨基酸在可见光区域无光吸收，在远紫外区（〈220nm〉均有光吸收，在近紫外区（220-300nm）只有 Tyr、Phe、 Trp 有吸收。 Tyr、Phe、Trp的R 基含有共轭双键，在220-300nm 紫外区有吸收。 λ（nm） ε Tyr 275 1.4×103 Phe 257 2.0×102 Trp 280 5.6×103 Lambert-Beer： 五、 氨基酸的酸碱性质（重点） 1、氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在 α-氨基酸都含有-COOH 和-NH2，都是不挥发的结晶固体，熔点 200-350℃，不溶于非极性溶剂，而易溶于水，这些 性质与典型的羧酸（R-COOH）或胺（R-NH2）明显不同。 三个现象： ①晶体溶点高→离子晶格，不是分子晶格。 ②不溶于非极性溶剂→极性分子 ③介电常数高（氨基酸使水的介电常数增高，而乙醇、丙酮使水的介电常数降低。）→水溶液中的氨基酸是极性分子。 = − = = c L T I I I A lg lg . 0
原因:a-羧基pK1在20左右,当pl3.5,a-羧基以OOO形式存在。a氨基pkK2在94左右,当pH80时,a氨 基以aNH3形式存在。在pHB5-80时,带有相反电荷,因此氨基酸在水溶液中是以两性离子离子形式存在 Gily溶点232℃比相应的乙酸(165℃)、乙胺(-805℃)高,可推测氨基酸在晶体状态也是以两性离子形式存在 2、氨基酸的两性解高和酸碱滴定曲线 HA A+H pH= pKa+Logl轭碱]/供共轭酸 pOH=pKb+log共轭酸/[共轭喊 (1)pH>pK时,{>[酸 pH=pK时,[碱]=[酸 pK时,[酯 (2)κK就是=酸时溶液的pH值,K就是此时溶液的 (3)当碱=[酸时,溶液的pH值等于κK (4)Gy的两性解离和滴定曲线 图3-14Gly的滴定曲线 在pH234和pH960处,Giy具有缓冲能力 滴定开始时,溶液中主要是Glyt 起点:100%Gy+净电荷:+ 第一拐点: 50%Gy+,50%Gy平均净电荷:+05 第二拐点:100%Gly2净电荷:0等电点pl 第三拐点:50%Gi*,50%Gy平均净电荷: 终点: 1009Gly净电荷:-1 第一拐点:pH=pK+gfG*]G,pHpK=234 第二拐点:100Gly,净电荷为0,此时的pH值称氨基酸的等电点pl 第三拐点:pHpK2+ Hgl gly nGly}kK2=96 Gly的等电点 K IGlyH] IGly[H] [Gly] IGly I k,·K2=m13 等电点时:[G}(G+ 等电点时氢离子浓度用I表示 2=K1·K2Pl=12(K+pK2) 中性aapI= pKa -cooh pKa-Nh3 酸性ap=n-COOp 碱性aapl N
８ 原因：α-羧基pK1 在2.0左右，当pH>3.5，α-羧基以-COO-形式存在。α-氨基pK2 在9.4左右，当pH pKa / 时，[碱] > [酸] pH = pKa / 时，[碱] = [酸] pH [碱] （2） pKa / 就是[碱] = [酸]时溶液的pH 值，Ka /就是此时溶液的[H+ ] （3）当[碱] = [酸]时，溶液的pH 值等于pKa / （4）Gly的两性解离和滴定曲线 图 3-14 Gly 的滴定曲线 在 pH2.34和pH9.60处，Gly具有缓冲能力。 滴定开始时，溶液中主要是Gly+。 起点：100% Gly+ 净电荷：+1 第一拐点： 50%Gly + ，50%Gly± 平均净电荷：+0.5 第二拐点： 100%Gly± 净电荷：0 等电点pI 第三拐点： 50%Gly± ， 50%Gly- 平均净电荷：-0.5 终点： 100% Gly- 净电荷：-1 第一拐点：pH=pK+lg[Gly± ]/[Gly+ ]，pH=pK1=2.34 第二拐点：100%Gly±，净电荷为0，此时的pH值称氨基酸的等电点pI。 第三拐点：pH=pK2+lg[Gly- ]/[Gly± ]=pK2=9.6 Gly 的等电点： 等电点时：[Gly-]=[Gly+] 等电点时氢离子浓度用I 表示 I 2=K1·K2 PI=1/2(pK1+pK2) [ ] [ ][ ] 1 + + = Gly Gly H K [ ] [ ] [ ] [ ] [ ][ ] 2 1 2 2 + − + − + • = • = Gly Gly K K H Gly Gly H K 2 . 2 . 2 . 3 3 R R pK NH pK a apI pK COOH pK a apI pK COOH pK NH a apI + + + − = − = − − = 碱性 酸性 中性
氨基酸在等电点状态下,溶解度最小 pH>pl时,氨基酸带负电荷,COOH解离成COO,向正极秘动。 pH=pl时,氨基酸净电荷为零 pH234 正+1.0-+0.5 pH=234 正 +0.5 234pH597正0.5-0 597~H960负0--0.5 pH>960 负-05--10 问题 (1)pH=k时,缓冲能力最大,等电点时缓冲能力最小。为什么? (2)p的计算(氨基酸,寡肽,等电点时各组分的比例分析 (3)不同pH下的组成分析和电泳行为 pH>p时,氨基酸带负电荷,COOH解离成COO,向正极秘动 pH=pl时,氨基酸净电荷为零,溶解度最小 H<pl时,氨基酸带正电荷,NH解离成NH3,向负极移动 (4)利用pl和pK确定各种氨基酸适合的酸碱爱冲范围 (5)计算不同氨基酸水溶液的pH值 (6)绘制滴定曲线(Gu) 根据P页表37中Gu的数据(pK1 a-COOH219,pK2aNH967, pKRR-COOH425,pl32) ①绘出滴定曲线 ②指出Gu和G各一半时的pH值 ③指出Gu总是带正电荷的plH范围 ④指出Gu和Gu能作为缓中液使用的pH范围 ②Gu和G各50时pH为967 ③pH<322时Glu总带正电荷 ④Gu和Glur缓冲范围pH425左右 P92表37,氨基酸的表观解离常数和等电点 ①从表中(P2)可以看出,氨基酸的a-羧基pka在1826间,比典型羧基的pa(如乙酸pKa为476)要小很多 说明氨基酸羧基的酸性此普通羧基强⑩00倍以上。主要原因是氨基酸中α-氨基对α-羧基解离的鐛响(场效应)。 图 ②表中只有Hs的咪唑基侧链在生理条件下不带电荷 在生理条件下,只有Hs有缓冲能力 血红蛋白中Hs含量高,在血液中具很强的缓冲能力。 六、氨基酸的化学性质 a-NH2参加的反应 l、酰化反应
９ 氨基酸在等电点状态下，溶解度最小 pH > pI 时，氨基酸带负电荷，-COOH 解离成-COO-，向正极移动。 pH = pI 时，氨基酸净电荷为零 pH 2.34 正 +1.0 — +0.5 pH=2.34 正 +0.5 2.349.60 负 -0.5 — -1.0 问题： （1）pH = pKa / 时，缓冲能力最大，等电点时缓冲能力最小。为什么？ （2）pI 的计算（氨基酸，寡肽），等电点时各组分的比例分析 （3）不同pH 下的组成分析和电泳行为 pH > pI 时，氨基酸带负电荷，-COOH 解离成-COO-，向正极移动。 pH = pI 时，氨基酸净电荷为零，溶解度最小 pH < pI 时，氨基酸带正电荷，-NH2解离成-N+H3，向负极移动。 （4）利用pI 和pKa /确定各种氨基酸适合的酸碱缓冲范围 （5）计算不同氨基酸水溶液的pH 值 （6）绘制滴定曲线（Glu） 根据 P92 页表3-7 中Glu的数据（pK1α-COOH 2.19， pK2α-N+H39.67，pKR R-COOH4.25，pI 3.22） ①绘出滴定曲线 ②指出 Glu-和Glu=各一半时的pH值 ③指出 Glu 总是带正电荷的pH 范围 ④指出 Glu±和Glu-能作为缓冲液使用的pH范围 ①解：见图 ②Glu-和Glu=各50%时pH为9.67 ③pH<3.22时 Glu 总带正电荷 ④Glu±和Glu-缓冲范围pH4.25 左右 P92 表 3-7，氨基酸的表观解离常数和等电点 ①从表中（P92）可以看出，氨基酸的α-羧基pKa在1.8-2.6间，比典型羧基的pKa（如乙酸pKa为 4.76）要小很多， 说明氨基酸羧基的酸性此普通羧基强100倍以上。主要原因是氨基酸中α-氨基对α-羧基解离的影响（场效应）。 图 ②表中只有His 的咪唑基侧链在生理条件下不带电荷。 在生理条件下，只有His 有缓冲能力。 血红蛋白中His 含量高，在血液中具很强的缓冲能力。 六、 氨基酸的化学性质 （一） α-NH2参加的反应 1、酰化反应
①酰化试剂:苄氧酰氯、叔丁氧甲酰氯、苯二甲酸酐、对-甲苯磺酰氯。这些酰化剂在多肽和蛋白质的人工合成中被 用作氨基保护剂 ②丹磺酰氯(DNSc,5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯) DNS—c可用于多肽链NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定 图 NGy-Aa- -Ser-LeurPhe C→→→→DNs- Gly-Ala- Ser-LeurPhe C 水解DNS-、Ala、Ser、Leu、Phe DNS-氨基酸在紫外光激发后发黄色荧光 ③蛋白质的合成 图 ④(生物体内)在酶和ATP存在条件下,羧酸也可与氨基酸的氨基作用,形成酰基化产物。 苯甲酸与Gly的氨基的酰基化反应是生物体内解毒作用的一个典型的例子 将经过匀浆的动物肝脏组织与Gy、苯甲酸和ATP混合保温,从混合液中可分离出N苯甲酸·Gy。 苯甲酸是食品防腐剂,在生物体内转变成N苯甲酰Gy后,可经尿排出 2、烷基化反应 a-氨基中的氮是一个亲核中心,能发生亲核取代反应。 ①肌氨酸是存在于生物组织中重要的组分,它是Gy甲基化的产物 图 ②强亲电的有机物能与αNH2发生烷基化反应 第一次大战中使用的芥子气,它的主要作用是使氨基酸的α-氨基烷基化,从而破坏蛋白质的正常功能。 图 ③ Sanger反应(24一二硝基氟苯,DNP) 二硝基苯基氨基酸(DNP氨基酸),黄色,层析法鉴定,被 Sanger用来测定多肽的N末端氨基酸。 ④ Edman反应(苯异硫氰酸酯,PIIC) 图 苯氨基硫甲酰衍生物(PIC-氨基酸)→苯乙内酰硫脲衍生物(PIH-氨基酸) PIH-氨基酸,无色,可以用层析法分离鉴定。被 Edman用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸 氨基酸的α氨基与醛类反应,生成西佛碱。 图 西佛碱是某些酶促反应的中间产物(如转氨基反应的中间产物)。 ⑥含硫氨基酸的烷基化反应 硫原子也是亲核中心,可发生亲核取代反应。 生物体内,最重要的甲基化剂是S-腺苷甲硫氨酸(SAM),是由Mt与AIP作用得到的S-烷基化产物 图 在酶催化下,SAM可以使多种生物分子的氨基甲基化,如磷脂酰胆碱的生物合成
１０ ①酰化试剂：苄氧酰氯、叔丁氧甲酰氯、苯二甲酸酐、对-甲苯磺酰氯。这些酰化剂在多肽和蛋白质的人工合成中被 用作氨基保护剂。 ②丹磺酰氯（DNS-cl，5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯） DNS—cl可用于多肽链—NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。 图 N Gly—Ala—Ser—Leu—Phe C →→→→ DNS—Gly—Ala—Ser—Leu—Phe C 水解 DNS—Gly、 Ala、 Ser、 Leu、 Phe DNS-氨基酸在紫外光激发后发黄色荧光。 ③蛋白质的合成 图 ④（生物体内）在酶和ATP存在条件下，羧酸也可与氨基酸的氨基作用，形成酰基化产物。 苯甲酸与Gly 的氨基的酰基化反应是生物体内解毒作用的一个典型的例子。 将经过匀浆的动物肝脏组织与Gly、苯甲酸和ATP混合保温，从混合液中可分离出N-苯甲酸一Gly。 图 苯甲酸是食品防腐剂，在生物体内转变成N-苯甲酰-Gly 后，可经尿排出。 2、烷基化反应 α-氨基中的氮是一个亲核中心，能发生亲核取代反应。 ①肌氨酸是存在于生物组织中重要的组分，它是Gly甲基化的产物： 图 ②强亲电的有机物能与α-NH2发生烷基化反应。 第一次大战中使用的芥子气，它的主要作用是使氨基酸的α-氨基烷基化，从而破坏蛋白质的正常功能。 图 ③Sanger 反应（2.4一二硝基氟苯，DNFP） 图 二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸），黄色，层析法鉴定，被Sanger 用来测定多肽的NH2末端氨基酸。 ④Edman反应（苯异硫氰酸酯，PITC） 图 苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-氨基酸） → 苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸） PTH-氨基酸，无色，可以用层析法分离鉴定。被Edman 用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸 ⑤生成西佛碱的反应（Schiff） 氨基酸的α氨基与醛类反应，生成西佛碱。 图 西佛碱是某些酶促反应的中间产物（如转氨基反应的中间产物）。 ⑥含硫氨基酸的烷基化反应 硫原子也是亲核中心，可发生亲核取代反应。 生物体内，最重要的甲基化剂是S-腺苷甲硫氨酸（SAM），是由Met 与ATP作用得到的S-烷基化产物。 图 在酶催化下，SAM 可以使多种生物分子的氨基甲基化，如磷脂酰胆碱的生物合成
