活性污泥中微生物分离纯化与培养 中国环境管理干都学完 环境技术研究与实验中心 LETCWAT r Cemre r Woter Trea
Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment 活性污泥中微生物分离纯化与培养 中国环境管理干部学院 环境技术研究与实验中心
>一、实验目的 1、掌握从环境（水体或活性污泥）中分离培养细菌的方法，从 而获得若干种细菌纯培养技能。 2、掌握几种接种技术。 >二、实验器材及设备 1、无菌培养皿（直径90毫米）、无菌吸管、无菌锥形瓶、无菌 试管、5管无菌水（每管有9毫升灭菌过的自来水）。 2、营养琼脂培养基（已灭菌的）、活性污泥。 3、接种环、酒精灯、恒温箱（培养箱）、超净工作台等。 DETCWAT Wa
Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment ➢ 一、实验目的 1、掌握从环境(水体或活性污泥)中分离培养细菌的方法，从 而获得若干种细菌纯培养技能。 2、掌握几种接种技术。 ➢ 二、实验器材及设备 1、无菌培养皿(直径90毫米)、无菌吸管、无菌锥形瓶、无菌 试管、5管无菌水(每管有9毫升灭菌过的自来水)。 2、营养琼脂培养基(已灭菌的)、活性污泥。 3、接种环、酒精灯、恒温箱(培养箱)、超净工作台等
>三、细菌纯种分离的操作方法 >细菌纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法 (一)稀释平板分离法 1、取样从活性污泥法曝气池中取活性污泥若干，于无菌烧 杯中（取用有代表性的样品）。 2、稀释水样 将1瓶90毫升和5管9毫升的无菌水排列好，按101、102 103、104、105及10-6依次编号。在无菌操作条件下，用10 毫升的无菌移液管吸取10毫升水样置于第一瓶90毫升无菌水 (内含玻璃珠)中，持移液管吹洗三次，用手摇10分钟将颗粒 状样品打散。即为10浓度的菌液。用引毫升无菌移液管吸取刻 毫升10浓度的菌液于一管9毫升无菌水中，将移液管吹洗三 次，摇匀即为102浓度菌液。同样方法，依次稀释到106 稀释过程如图 DETCWAT
Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment ➢ 三、细菌纯种分离的操作方法 ➢ 细菌纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法 （一）稀释平板分离法 1、取样 从活性污泥法曝气池中取活性污泥若干，于无菌烧 杯中(取用有代表性的样品)。 2、稀释水样 将1瓶90毫升和5管9毫升的无菌水排列好，按10-1 、10-2 、 10-3 、10-4 、10-5及10-6依次编号。在无菌操作条件下，用10 毫升的无菌移液管吸取10毫升水样置于第一瓶90毫升无菌水 (内含玻璃珠)中，持移液管吹洗三次，用手摇10分钟将颗粒 状样品打散。即为10-1浓度的菌液。用l毫升无菌移液管吸取l 毫升10-1浓度的菌液于一管9毫升无菌水中，将移液管吹洗三 次，摇匀即为10-2浓度菌液。同样方法，依次稀释到10-6 。 稀释过程如图
培关基 【mLI mi1」mlIm 手 1mL或 0.5m. 3 样品稀释过程 LETCWAT r Cemre r Woter Trea ning
Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment 样品稀释过程
>3、平板的制作 取10套无菌培养皿编号，104、105、10-6各3个，另1个为 空气对照。取1支1mL无菌移液管从浓度小的10-6菌液开始， 以10-6、105、104为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培 养血内（注：每次吸取前，角移液管在菌液中吹泡使菌液充 分混勾)加热融化培养基， 当培养基冷至45°℃左右时， 石 拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、 无名指 和小指托住血底，拇指和食指夹住血盖。 靠近火焰 将皿 盖掀开， 倒入培养基后将瘙养严平放在皋上： 顺时针和反 时针来回转动培养皿， 使培养基和菌液充分混 冷凝后 即晟伞板，倒置于30C塔养2448n,然后观察结 取“对照”的无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖 10min后盖上皿盖。倒置于30C培养24~48h后观察结果 倒平板 DETCWAT "88
Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment ➢ 3、平板的制作 取10套无菌培养皿编号，10-4 、10-5 、10-6各3个，另1个为 空气对照。取1支1mL无菌移液管从浓度小的10-6菌液开始， 以10-6 、10-5 、10-4为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培 养皿内(注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充 分混勾)加热融化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手 拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指 和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖．靠近火焰，将皿 盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和反 时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后 即成平板，倒置于30℃培养24～48h，然后观察结果。 取“对照”的无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖 10min后盖上皿盖。倒置于30℃培养24～48h后观察结果。 倒平板
>（二)平板划线分离法 1、平板的制作 将融化并冷至约50°℃的肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培 养皿内，使凝固成平板。 2、操作 用接种环挑取一环活性污泥（或土壤悬液等），左手拿培养皿 中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖。将 培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接 种环伸入培养皿内。在平板上轻轻划线（切勿划破培养基）， 划线的方式可取下图中任何一种。划线完毕盖好皿盖，倒 30°℃培养24~48h后观察结果。 DETCWAT
Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment ➢ (二)平板划线分离法 1、平板的制作 将融化并冷至约50℃的肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培 养皿内，使凝固成平板。 2、操作 用接种环挑取一环活性污泥(或土壤悬液等)，左手拿培养皿， 中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖．将 培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接 种环伸入培养皿内．在平板上轻轻划线(切勿划破培养基)， 划线的方式可取下图中任何一种。划线完毕盖好皿盖，倒 置．30℃培养24～48h后观察结果
四、接种技术操作 > 由于实验的目的、所研究的微生物种类、所用的培养基及 容器的不同，因此，接种方法也有多种，如斜面接种技术 液体培养基中的菌种被接入液体培养基、液体接种、穿刺 接种、稀释平板涂布法等 >本实验中只对稀释平板涂布法进行简单介绍 >稀释平板涂布法与稀释平板法、平板划线法的作用一样， 都是把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌 落的分离方法。此法接种量不宜太多，只能在0.5以下， 培养时起初不能倒置，先正摆一段时间等水分蒸发后倒置。 eWer Tre
Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment 四、接种技术操作 ➢ 由于实验的目的、所研究的微生物种类、所用的培养基及 容器的不同，因此，接种方法也有多种，如斜面接种技术 、 液体培养基中的菌种被接入液体培养基、液体接种 、穿刺 接种、稀释平板涂布法等 ➢ 本实验中只对稀释平板涂布法进行简单介绍 ➢ 稀释平板涂布法与稀释平板法、平板划线法的作用一样， 都是把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌 落的分离方法。此法接种量不宜太多，只能在0.5ml以下， 培养时起初不能倒置，先正摆一段时间等水分蒸发后倒置
>实验步骤如下： 1)稀释样品：方法与稀释平板法中的稀释方法和步骤一样。 2)倒平板：将融化的并冷至50°℃左右的培养基倒入无菌培养 皿中，冷凝后即成平板。 3)用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的样品液于平板上， 换上无菌玻璃刮铲在平板上旋转涂布均匀。 4)正摆在所需温度的恒温箱内培养，如果培养时间较长，次 日把培养倒置继续培养。 5)待长出菌落观察结果。 DETCWAT "88
Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment ➢ 实验步骤如下： 1)稀释样品：方法与稀释平板法中的稀释方法和步骤一样。 2)倒平板：将融化的并冷至50℃左右的培养基倒入无菌培养 皿中，冷凝后即成平板。 3)用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的样品液于平板上， 换上无菌玻璃刮铲在平板上旋转涂布均匀。 4)正摆在所需温度的恒温箱内培养，如果培养时间较长，次 日把培养倒置继续培养。 5)待长出菌落观察结果
>五、思考题 用一根无菌移液管接种几种浓度的水祥时， 应从哪个浓度开始？为什么？ DETCWAT
Sino-Dutch Demonstration Researcher and Training Centre for Water Treatment ➢ 五、思考题 用一根无菌移液管接种几种浓度的水祥时， 应从哪个浓度开始？为什么?