微生物学实验讲义 内蒙古科技大学数理与生物工程学院 自治区基础生物实验示范中心 基础生物教学部 2010年10月
微生物学实验讲义 内蒙古科技大学数理与生物工程学院 自治区基础生物实验示范中心 基础生物教学部 2010 年 10 月 1
前言 一、本课程的性质和任务 微生物学实验是生物学重要的基础课之一，特别是随若分子生物学的发展与 拓宽，微生物学方法与技术显得尤为重要。此外，医学、农学、林学等学科，甚 至地质学、太空学等也需微生物的方法与技术。因此，熟悉掌握微生物学方法与 技术，对其它很多学科的发展有直接的影响。无菌操作技能和无菌概念的建立是 微生物学实验中最重要的内容，微生物学实验课主要任务是使学生掌握研究与应 用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使 学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验 技能。与微生物学基础理论课紧密结合，使学生将理性知识与感性认识有机地结 合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力 与创新意识。提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使 学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何 研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。 二、教学要求与教学方法 1.教学要求 1)注重微生物学基础实验技能的掌握与提高，克服盲目追求新颖而忽视基础的 倾向： 2)实验课前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤： 3)在实验中要有严紧的科学态度，尊重事实与实验结果，要善于发现新现象： 4)树立密切合作的风气，包括学生与老师、班与班、组与组、组长与组员之间 的密配合。 2.教学方法 1)以学生自己动手为主，老师在适当时间予以提示： 2)对实验中所出现的一些现象多向学生提出问题，使它们学会分析结果，并与 理论知识有机结合： 3)根据实验的进行程度，引导学生更深入思考，逐步树立他们的创新意思：
前言 一、本课程的性质和任务 微生物学实验是生物学重要的基础课之一，特别是随着分子生物学的发展与 拓宽，微生物学方法与技术显得尤为重要。此外，医学、农学、林学等学科，甚 至地质学、太空学等也需微生物的方法与技术。因此，熟悉掌握微生物学方法与 技术，对其它很多学科的发展有直接的影响。无菌操作技能和无菌概念的建立是 微生物学实验中最重要的内容，微生物学实验课主要任务是使学生掌握研究与应 用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使 学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验 技能。与微生物学基础理论课紧密结合，使学生将理性知识与感性认识有机地结 合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力 与创新意识。提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使 学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何 研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。 二、教学要求与教学方法 1. 教学要求 1) 注重微生物学基础实验技能的掌握与提高，克服盲目追求新颖而忽视基础的 倾向； 2) 实验课前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤； 3) 在实验中要有严紧的科学态度，尊重事实与实验结果，要善于发现新现象； 4) 树立密切合作的风气，包括学生与老师、班与班、组与组、组长与组员之间 的密配合。 2. 教学方法 1) 以学生自己动手为主，老师在适当时间予以提示； 2) 对实验中所出现的一些现象多向学生提出问题，使它们学会分析结果，并与 理论知识有机结合； 3) 根据实验的进行程度，引导学生更深入思考，逐步树立他们的创新意思； 2
4)严格要求使操作技能规范化，老师作示范，强调其要点学生自己练， 三、教学安排 按教学要求微生物实验由基础必做实验、选做实验、综合设计性实验三部分 组成。其中实验一至五为基础必做实验，实验六至十四为选做实验，实验十五为 综合设计性实验。学生在实验指导教师指导下须完成十个实验。 四、实验考核 考核由以下几部分组成： 平时出勤(20%)+实验动手能(20%)+实验报告册书写(60%) 3
4) 严格要求使操作技能规范化，老师作示范，强调其要点学生自己练。 三、教学安排 按教学要求微生物实验由基础必做实验、选做实验、综合设计性实验三部分 组成。其中实验一至五为基础必做实验，实验六至十四为选做实验，实验十五为 综合设计性实验。学生在实验指导教师指导下须完成十个实验。 四、实验考核 考核由以下几部分组成： 平时出勤（20%）+实验动手能（20%）+实验报告册书写（60%） 3
目录 实验一 常用培养基的制备、灭菌与消毒5 实验二 普通光学显徽镜的使用12 实验三 革兰氏染色法18 实验四 显徽镜直接计数法21 实验五 微生物接种技术24 实验六 细菌简单染色法.30 实验七 酸乳中乳酸菌的测定.33 实验八 水中细菌总数的测定.36 实验九 细菌总DNA的提取39 实验十 微生物菌种保藏方法. .41 实验十一微生物遗传实验抗药性突变株的分离.46 实验十二大肠杆菌生长曲线的测定.48 实验十三爆菌的形态观察50 实验十四酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定52 实验十五新型污水处理絮凝剂一生物絮凝剂的制备54 实验十六乳酸菌的分离纯化和酸奶的制作58 实验十七金霉素发酵62
目 录 实验一 常用培养基的制备、灭菌与消毒.5 实验二 普通光学显微镜的使用.12 实验三 革兰氏染色法.18 实验四 显微镜直接计数法.21 实验五 微生物接种技术.24 实验六 细菌简单染色法.30 实验七 酸乳中乳酸菌的测定.33 实验八 水中细菌总数的测定.36 实验九 细菌总 DNA 的提取.39 实验十 微生物菌种保藏方法.41 实验十一 微生物遗传实验-抗药性突变株的分离.46 实验十二 大肠杆菌生长曲线的测定.48 实验十三 霉菌的形态观察.50 实验十四 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定.52 实验十五 新型污水处理絮凝剂——生物絮凝剂的制备.54 实验十六 乳酸菌的分离纯化和酸奶的制作.58 实验十七 金霉素发酵.62 4
实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 1.了解培养基的配制原理：掌握配制培养基的一般方法和步骤： 2.了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。 3.学习高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要 的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氨源、无机盐、生长因素和 水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又 称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营 养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种 灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力 达到1.05kgcm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15一30min,可全部杀死锅 内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性 标本和工作服等都可应用此法灭菌。 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使 灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中 驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压 力，从而使沸点增高，高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的 目的。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体 吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的 穿透力比千热大：三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为 液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度， 从而增加灭菌效力。 5
实验一 常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 1．了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤； 2．了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。 3．学习高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要 的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和 水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又 称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营 养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种 灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力 达到 1.05kg/cm2 时，水蒸气的温度升高到 121℃，经 15～30min，可全部杀死锅 内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性 标本和工作服等都可应用此法灭菌。 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内,通过加热,使 灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中 驱尽,然后关闭排气阀,继续加热,此时由于蒸汽不能溢出,而增加了灭菌器内的压 力,从而使沸点增高,高于 100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的 目的。 在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,其原因有三：一是湿热中细菌菌体 吸收水分,蛋白质较易凝固,因蛋白质含水量增加,所需凝固温度降低,二是湿热的 穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在,每 1 克水在 100℃时,由气态变为 液态时可放出 2．26kJ(千焦)的热量。这种潜热,能迅速提高被灭菌物体的温度, 从而增加灭菌效力。 5
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因 为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力 下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 一般培养基用1.05kgcm2,121.3℃15一30分钟可达到彻底灭菌的目的。 灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如 含糖培养基用0.56kgcm2(8磅/英寸2,112.6℃灭菌15分钟，但为了保证效果， 可将其他成分先行121.3℃，20分钟灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶 液。又如盛于试管内的培养基以1.05kgcm2,121.3℃灭菌20分钟即可，而盛于 大瓶内的培养基最好以1.05kgcm2灭菌30分钟。 蒸汽压力所用单位为kgcm(千克/厘米3 实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式、卧式和手提式等几种。 三、实验器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、 高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培 养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaC1、琼脂 四、实验流程 称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记一→灭菌→摆斜面或倒 平板 五、实验步骤 1.培养基的制备 1)称量药品 根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要 加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2)溶解 用量筒取一定量（约占总量的12）蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉 上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热， 6
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要,因 为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压,所以,当水蒸汽中含有空气时,在同一压力 下,含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 一般培养基用 1．05kg /cm2 ,121．3℃ 15—30 分钟可达到彻底灭菌的目的。 灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如 含糖培养基用 0．56kg/cm2(8 磅/英寸 2),112．6℃灭菌 15 分钟,但为了保证效果, 可将其他成分先行 121．3℃,20 分钟灭菌,然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶 液。又如盛于试管内的培养基以 1．05kg/cm2 ,121．3℃灭菌 20 分钟即可,而盛于 大瓶内的培养基最好以 1．05kg/cm2 灭菌 30 分钟。 蒸汽压力所用单位为kg/cm2 (千克/厘米2 ) 实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式、卧式和手提式等几种。 三、实验器材 1．器材 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、 高压蒸汽灭菌锅、pH 度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培 养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2．试剂 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验流程 称药品→溶解→调 pH 值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒 平板 五、实验步骤 1．培养基的制备 1）称量药品 根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要 加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2） 溶解 用量筒取一定量(约占总量的 1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉 上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热， 6
补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热 搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。 3)调节pH 根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或S%HC1溶液调至所需pH。测定 pH可用pH试纸或酸度计等。 4)溶化琼脂 固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一 面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分（水需预热）。注意控制 火力不要使培养基溢出或烧焦。 5)过滤分装 先将过滤装置安装好。如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是 固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂 棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或 瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度以试管高度的14左右为宜。固 体分装装量为管高的15，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜：分装三 角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。 6)包扎标记 培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装 纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。 7)灭菌 上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121 ℃20min,以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需 要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长 度的12为宜：半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。 8)倒平板 将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到45~50℃，立刻倒平板 2.高压灭菌操作步骤 1)首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为 宜。 7
补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热 搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。 3）调节 pH 根据培养基对 pH 的要求，用 5%NaOH 或 5%HC1 溶液调至所需 pH。测定 pH 可用 pH 试纸或酸度计等。 4）溶化琼脂 固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一 面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制 火力不要使培养基溢出或烧焦。 5） 过滤分装 先将过滤装置安装好。如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是 固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂 棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或 瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度以试管高度的 1/4 左右为宜。固 体分装装量为管高的 1/5，半固体分装试管一般以试管高度的 1/3 为宜；分装三 角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。 6）包扎标记 培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装 纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。 7）灭菌 上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为 121 ℃ 20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需 要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长 度的 1/2 为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。 8）倒平板 将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到 45～50℃,立刻倒平板 2．高压灭菌操作步骤 1）首先将内层灭菌桶取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为 宜。 7
2)放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响 灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而 透入棉塞。 3)加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式 同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致勿使漏气。 4)用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空 气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压 力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用1.05kgcm2,121.3 ℃，20分钟灭菌。 5)灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表 的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到 0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平 衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。 6)将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待 用。 六、实验结果 检查培养基灭菌是否彻底， 七、注意事项 1.要严格按配方配制 2.调pH不要过头。 3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70°C以下放物、 取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要 注意清洗保存。 八、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？
2）放回灭菌桶,并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤,以免防碍蒸汽流通而影响 灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而 透入棉塞。 3）加盖,并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式 同时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气。 4）用电炉或煤气加热,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空 气完全排尽后,关上排气阀,让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压 力升到所需压力时,控制热源,维持压力至所需时间。本实验用 1．05kg/cm2,121．3 ℃,20 分钟灭菌。 5）灭菌所需时间到后,切断电源或关闭煤气,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表 的压力降至 0 时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。如果压力未降到 0 时,打开排气阀,就会因锅内压力突然下降,使容器内的培养基由于内外压力不平 衡而冲出烧瓶口或试管口,造成棉塞沾染培养基而发生污染。 6）将取出的灭菌培养基放入 37℃温箱培养 24 小时,经检查若无杂菌生长,即可待 用。 六、实验结果 检查培养基灭菌是否彻底。 七、注意事项 1．要严格按配方配制。 2．调 pH 不要过头。 3．干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70ºC 以下放物、 取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。 5．过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要 注意清洗保存。 八、思考题 1．培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的? 8
2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？ 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件？为什么？ 4.培养基的配制原则是什么？ 5.高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？ 6.灭菌完毕后，为什么要待压力降到0时才能打开排气阀，开盖取物？ 7.在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？ 附件各种细菌培养基配方 1.细菌培养基 配方一牛肉青琼脂培养基 牛肉膏0.3克蛋白胨1.0克 氯化钠0.5克琼脂1.5克 水1000毫升 在烧杯内加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用蜡笔在烧杯外作 上记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂，不断搅拌以免粘 底。等琼脂完全溶解后补足失水，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到 7.2~7.6,分装在各个试管里，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌20分钟。 配方二马铃薯培养基 取新鲜牛心（除去脂肪和血管）250克，用刀细细剁成肉末后，加入500毫 升蒸馏水和5克蛋白胨。在烧杯上做好记号，煮沸，转用文火炖2小时。过滤， 滤出的肉末干燥处理，滤液p州值调到7.5左右。每支试管内加入10毫升肉汤和 少量碎末状的干牛心，灭菌，备用。 配方三根瘤菌培养基 葡萄糖10克磷酸氢二钾0.5克 碳酸钙3克硫酸镁 0.2克 酵母粉0.4克琼脂20克 水1000毫升1%结晶紫溶液1毫升 先把琼脂加水煮沸溶解，然后分别加入其他组分，搅拌使溶解后，分装，灭 菌，备用。 2.放线菌培养基
2．在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3．培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4．培养基的配制原则是什么? 5．高压蒸汽灭菌开始之前,为什么要将锅内冷空气排尽？ 6．灭菌完毕后,为什么要待压力降到 0 时才能打开排气阀,开盖取物？ 7．在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,怎样杜绝一切不安全的因素？ 附件 各种细菌培养基配方 1．细菌培养基 配方一 牛肉膏琼脂培养基 牛肉膏 0.3 克 蛋白胨 1.0 克 氯化钠 0.5 克 琼脂 1.5 克 水 1000 毫升 在烧杯内加水 100 毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用蜡笔在烧杯外作 上记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂，不断搅拌以免粘 底。等琼脂完全溶解后补足失水，用 10%盐酸或 10%的氢氧化钠调整 pH 值到 7.2～7.6,分装在各个试管里，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌 20 分钟。 配方二 马铃薯培养基 取新鲜牛心（除去脂肪和血管）250 克，用刀细细剁成肉末后，加入 500 毫 升蒸馏水和 5 克蛋白胨。在烧杯上做好记号，煮沸，转用文火炖 2 小时。过滤， 滤出的肉末干燥处理，滤液 pH 值调到 7.5 左右。每支试管内加入 10 毫升肉汤和 少量碎末状的干牛心，灭菌，备用。 配方三 根瘤菌培养基 葡萄糖 10 克 磷酸氢二钾 0.5 克 碳酸钙 3 克 硫酸镁 0.2 克 酵母粉 0.4 克 琼脂 20 克 水 1000 毫升 1%结晶紫溶液 1 毫升 先把琼脂加水煮沸溶解，然后分别加入其他组分，搅拌使溶解后，分装，灭 菌，备用。 2.放线菌培养基 9
配方一淀粉琼脂培养基（高氏培养基） 可溶性淀粉2克硝酸钾0.1克 磷酸氢二钾0.05克氯化钠0.05克 硫酸镁0.05克硫酸亚铁0.001克 琼脂2克水1000毫升 先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加 入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌 待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2~7.4，分装后灭菌，备用。 配方二面粉琼脂培养基 面粉60克琼脂20克 水1000毫升 把面粉用水调成糊状，加水到500毫升，放在文火上煮30分钟。另取500 毫升水，放入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，补充水分，调整pH值到 7.4,分装，灭菌，备用。 3.真菌培养基 配方一萨市(Sabouraud's)培养基 蛋白胨10克琼脂20克 麦芽糖40克水1000毫升 先把蛋白胨、琼脂加水后，加热，不断搅拌，待琼脂溶解后，加入40克麦 芽糖（或葡萄糖），搅拌，使它溶解，然后分装，灭菌，备用。本培养菌是培 养许多种类真菌所常用的。 配方二马铃薯糖琼脂培养基 把马铃薯洗净去皮，取200克切成小块，加水1000毫升，煮沸半小时后， 补足水分。在滤液中加入10克琼脂，煮沸溶解后加糖20克（用于培养霉菌的加 入蔗糖，用于培养酵母菌的加入葡萄糖)，补足水分，分装，灭菌，备用。 把这培养基的pH值调到7,2~7.4，配方中的糖，如用葡萄糖还可用来培养放线 菌和芽孢杆菌。 配方三黄豆芽汁培养基 黄豆芽100克琼脂15克
配方一 淀粉琼脂培养基（高氏培养基） 可溶性淀粉 2 克 硝酸钾 0.1 克 磷酸氢二钾 0.05 克 氯化钠 0.05 克 硫酸镁 0.05 克 硫酸亚铁 0.001 克 琼脂 2 克 水 1000 毫升 先把淀粉放在烧杯里，用 5 毫升水调成糊状后，倒入 95 毫升水，搅匀后加 入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌， 待琼脂完全溶解后，补足失水。调整 pH 值到 7.2～7.4，分装后灭菌，备用。 配方二 面粉琼脂培养基 面粉 60 克 琼脂 20 克 水 1000 毫升 把面粉用水调成糊状，加水到 500 毫升，放在文火上煮 30 分钟。另取 500 毫升水，放入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，补充水分，调整 pH 值到 7.4，分装，灭菌，备用。 3. 真菌培养基 配方一 萨市（Sabouraud's）培养基 蛋白胨 10 克 琼脂 20 克 麦芽糖 40 克 水 1000 毫升 先把蛋白胨、琼脂加水后，加热，不断搅拌，待琼脂溶解后，加入 40 克麦 芽糖（或葡萄糖），搅拌，使它溶解，然后分装，灭菌，备用。 本培养菌是培 养许多种类真菌所常用的。 配方二 马铃薯糖琼脂培养基 把马铃薯洗净去皮，取 200 克切成小块，加水 1000 毫升，煮沸半小时后， 补足水分。在滤液中加入 10 克琼脂，煮沸溶解后加糖 20 克（用于培养霉菌的加 入蔗糖，用于培养酵母菌的加入葡萄糖），补足水分，分装，灭菌，备用。 把这培养基的 pH 值调到 7.2～7.4，配方中的糖，如用葡萄糖还可用来培养放线 菌和芽孢杆菌。 配方三 黄豆芽汁培养基 黄豆芽 100 克 琼脂 15 克 10