核酸杂交技术 徐艺文16307130289 技术原理 核酸杂交技术原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因 素作用下双链解开,而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。 NOIN NO 0000 DNA double helices denaturation to renaturation restore (nucleotide pairs (nucleotide pairs re-formed) broken) 变性 退火 复性 把经酶切的、电泳分离的、经碱变性后生成单链分子的待检测核酸片段转印 到特定的膜上,用已知特定序列的标记探针与之杂交,以检验该核酸片段是否与 根据检测样品的不同又被分为DNA印迹杂交( Southern blot hybridization)和 RNA印迹杂交( Northern blot hybridization)。 核酸分子杂交的操作程序如下图所示: 制备待测核酸样品 制备核酸探针 分离、变性、转移、固化DNA片段 标记核酸探针 预杂交 加入标记核酸探针 杂交 漂洗去除未参与杂交的标记探针 检测杂交信号
核酸杂交技术 徐艺文 16307130289 一、技术原理 核酸杂交技术原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因 素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。 把经酶切的、电泳分离的、经碱变性后生成单链分子的待检测核酸片段转印 到特定的膜上，用已知特定序列的标记探针与之杂交，以检验该核酸片段是否与 已知的探针有同源序列。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。 根据检测样品的不同又被分为 DNA 印迹杂交（Southern blot hybridization ）和 RNA 印迹杂交（Northern blot hybridization）。 核酸分子杂交的操作程序如下图所示： 制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化 DNA 片段 预杂交 制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针 杂交 漂洗去除未参与杂交的标记探针 检测杂交信号
核酸探针是指带有标记的某一特定DNA或RNA片段,用已知碱基序列的单 链核酸片段作为探针,与待测样本中的单链核酸互补配对,以判断有无互补的同 源核酸序列的存在 标记物 标记探针 杂交体 空登空 标记探针与为标记探针 最常用的探针是DNA探针,DNA探针又分为寡核苷酸探针、基因组DNA探 针和cDNA探针其优点在于,这类探针大多克隆在质粒载体中,可以无限繁殖制 备方法简便,且DNA探针相对不易被降解,一般DNA酶活性能有效的被抑制, 它的标记方法较成熟,有多种方法可供选择,如缺口平移法、随机引物法、PCR 标记法等,能用于放射性核素和非放射性物质标记 另一类探针是RNA探针,优点在于杂交效率髙稳定性髙,非特异性杂交较少 未杂交探针可以用 RNase降解,减少本底的干扰,但它易降解,而且标记方法较 为复杂 DNase I. Mg2 DNA酶I:在双链DNA 上随机打开若干个单 链缺口,产生3’-0 DNA聚合酶 dATP. dGTP dTTP [a-32PI-dCTP 大肠杆菌DNA聚合酶I 5,→3’DNA聚合酶 活性;5,→3,外切 核酸酶活性 变性 32P部分标记的 单链DNA片段 ↑切口原始位置 32P标记的DNA 个切口最终位置 缺口平移法原理图 缺口平移法的制作原理大致如上图所示,而下图是随机引物法的大致原理 图,随机引物是含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物,在下图过程中, 可见其保留了5′->3DNA聚合酶活性,弱3′->5′外切酶活性,无5′->3′外切酶活性 p-dNTP, Bio-Dntp Klenow, dNTP 3<uIl 随机引物法原理图
核酸探针是指带有标记的某一特定 DNA 或 RNA 片段，用已知碱基序列的单 链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同 源核酸序列的存在。 最常用的探针是 DNA 探针，DNA 探针又分为寡核苷酸探针、基因组 DNA 探 针和 cDNA 探针其优点在于，这类探针大多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖制 备方法简便，且 DNA 探针相对不易被降解，一般 DNA 酶活性能有效的被抑制， 它的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、PCR 标记法等，能用于放射性核素和非放射性物质标记。 另一类探针是 RNA 探针，优点在于杂交效率高稳定性高，非特异性杂交较少， 未杂交探针可以用 RNase 降解，减少本底的干扰，但它易降解，而且标记方法较 为复杂。 缺口平移法的制作原理大致如上图所示，而下图是随机引物法的大致原理 图，随机引物是含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，在下图过程中， 可见其保留了 5’->3’DNA 聚合酶活性，弱 3’->5’外切酶活性，无 5’->3’外切酶活性 标记探针与为标记探针 缺口平移法原理图 随机引物法原理图
而要分离杂交探针,则需先提取某一病原微生物株系的染色体DNA,后用限 制性内切酶进行酶解,得到的酶解片段克隆进一质粒载体,构建质粒文库,文库 中重组质粒的插入片段可用以分别同病原性微生物和非病原性微生物的核DNA 进行杂交、筛选。 技术应用: 目前,已有很多病毒基因探针可用于病毒病原学的研究,如乙型肝炎病毒 单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒和轮状病毒等等。 人们用这些病毒基因探针检査血清、体液及相应组织中病毒基因,探讨病毒 基因与肿瘤和其它一些疾病的关系。我们曾应用 HFRSV探针检测HFRS尸检组织 中广泛分布有 HERSV。并与组织免疫复合物沉积、病毒抗原分布和病理变化结合 分析,以探讨HFRS的发病机理 核酸分子杂交在肿瘤学中主要用于探讨病毒基因与肿瘤发生的关系、检测肿 瘤组织中癌基因并探讨病毒致癌基因用于肿瘤病理诊断的可能性。 病毒基因与肿瘤的关系的研究较多,如鼻咽癌与HBV,传染性单核细胞增多 症、 Burkitts淋巴瘤与EBV,宫颈癌与HSV、HPV-16,肝癌与HBV等肿瘤性疾病 与病毒感染的关系。其方法主要是通过癌组织中病毒基因的检测来分析二者之间 的相关关系。 用核酸杂交检测癌组织及癌旁组织、癌前病变的癌基因的报道也很多。这些 研究的目的主要是探讨癌基因在其肿瘤发生学中的意义。研究曾从微量石蜡包埋 的胃癌组织中制备DNA,采用聚合酶链反应(PCR)和寡脱氧核苷酸(ODN)探 针杂交方法,检测我国胃癌患者组织中是否存在H-ras癌基因第12位密码子的 G-xT突变,结果在17例胃癌中有5例存在这种点突变。而7例胃溃疡无1例发 生突变,提示Hras癌基因第12位密码子的G>T突变可能导致胃癌中癌基因的 激活。 病毒致癌基因是被逆转录病毒所转导的,细胞致癌基因存在正常细胞内,它 可被特异的点突变、启动因子诱导,基因扩增和染色体的重排等激活,应用病毒 癌基因探针可检测细胞癌基因序列,一旦致癌机理被了解后,探针即可用于肿瘤 的"基因诊断"。 人类遗传病的诊断核酸杂交可用于人类遗传病的产前诊断。其方法是从羊水 中分离胚胎纤维母细胞或取绒毛膜细胞的DNA,经酶切以吸印法将DNA转移至 硝酸纤维滤膜上,与特异的基因探针杂交,从酶切图谱的变化可对某些遗传病做 出诊断。目前已能对60种生化遗传病做出产前诊断。经典的核酸杂交法为 Southern杂交,常用于疾病的产前诊断,如镰形细胞贫血、苯丙酮酸尿症、血友 病、假肥大性肌营养不良等等 带有分离片段的琼糖股 酶消化的DNA片段 X光片 交自呈影 Southern杂交
而要分离杂交探针，则需先提取某一病原微生物株系的染色体 DNA，后用限 制性内切酶进行酶解，得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库，文库 中重组质粒的插入片段可用以分别同病原性微生物和非病原性微生物的核 DNA 进行杂交、筛选。 二、技术应用： 目前，已有很多病毒基因探针可用于病毒病原学的研究，如乙型肝炎病毒、 单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒和轮状病毒等等。 人们用这些病毒基因探针检查血清、体液及相应组织中病毒基因，探讨病毒 基因与肿瘤和其它一些疾病的关系。我们曾应用 HFRSV 探针检测 HFRS 尸检组织 中广泛分布有 HFRSV。并与组织免疫复合物沉积、病毒抗原分布和病理变化结合 分析，以探讨 HFRS 的发病机理。 核酸分子杂交在肿瘤学中主要用于探讨病毒基因与肿瘤发生的关系、检测肿 瘤组织中癌基因并探讨病毒致癌基因用于肿瘤病理诊断的可能性。 病毒基因与肿瘤的关系的研究较多，如鼻咽癌与 HBV，传染性单核细胞增多 症、Burkitt’s 淋巴瘤与 EBV，宫颈癌与 HSV、HPV-16，肝癌与 HBV 等肿瘤性疾病 与病毒感染的关系。其方法主要是通过癌组织中病毒基因的检测来分析二者之间 的相关关系。 用核酸杂交检测癌组织及癌旁组织、癌前病变的癌基因的报道也很多。这些 研究的目的主要是探讨癌基因在其肿瘤发生学中的意义。研究曾从微量石蜡包埋 的胃癌组织中制备 DNA，采用聚合酶链反应（PCR）和寡脱氧核苷酸（ODN）探 针杂交方法，检测我国胃癌患者组织中是否存在 H-ras 癌基因第 12 位密码子的 G->T 突变，结果在 17 例胃癌中有 5 例存在这种点突变。而 7 例胃溃疡无 1 例发 生突变，提示 H-ras 癌基因第 12 位密码子的 G->T 突变可能导致胃癌中癌基因的 激活。 病毒致癌基因是被逆转录病毒所转导的，细胞致癌基因存在正常细胞内，它 可被特异的点突变、启动因子诱导，基因扩增和染色体的重排等激活，应用病毒 癌基因探针可检测细胞癌基因序列，一旦致癌机理被了解后，探针即可用于肿瘤 的＂基因诊断＂。 人类遗传病的诊断核酸杂交可用于人类遗传病的产前诊断。其方法是从羊水 中分离胚胎纤维母细胞或取绒毛膜细胞的 DNA，经酶切以吸印法将 DNA 转移至 硝酸纤维滤膜上，与特异的基因探针杂交，从酶切图谱的变化可对某些遗传病做 出诊断。目前已能对 60 种生化遗传病做出产前诊断。经典的核酸杂交法为 Southern 杂交，常用于疾病的产前诊断，如镰形细胞贫血、苯丙酮酸尿症、血友 病、假肥大性肌营养不良等等。 Southern 杂交
除以上三方面外,目前核酸杂交已广泛用于细菌、病毒和寄生虫病的诊断和 流行病学调査,以及某些疾病发病机理的探讨等。 三、技术优缺点 检测某一疾病的病因是否由病毒引起的主要手段是采用体外敏感细胞感染 和组织培养分离病毒,电镜观察组织寻找病毒颗粒,血清学方法和免疫细胞化学 方法检测组织病毒抗原等等。核酸杂交方法与这些传统方法比较,具有髙特异性 及快速的优点,灵敏度和可靠性极高,而且不依赖于病毒的复制,可检査细胞中 已存在的病毒基因,而在对寄生虫感染的诊断方法中,杂交方法可以分辨不同种 的寄生虫,不需要以前有寄生虫感染病史,从理论上说,用此方法来诊断疾病可 用于对所有的致病微生物的检测;但其缺点也很明显,花费高、步骤多,有时会 有假阳性和假阴性
除以上三方面外，目前核酸杂交已广泛用于细菌、病毒和寄生虫病的诊断和 流行病学调查，以及某些疾病发病机理的探讨等。 三、技术优缺点： 检测某一疾病的病因是否由病毒引起的主要手段是采用体外敏感细胞感染 和组织培养分离病毒，电镜观察组织寻找病毒颗粒，血清学方法和免疫细胞化学 方法检测组织病毒抗原等等。核酸杂交方法与这些传统方法比较，具有高特异性 及快速的优点，灵敏度和可靠性极高，而且不依赖于病毒的复制，可检查细胞中 已存在的病毒基因，而在对寄生虫感染的诊断方法中，杂交方法可以分辨不同种 的寄生虫，不需要以前有寄生虫感染病史，从理论上说，用此方法来诊断疾病可 用于对所有的致病微生物的检测；但其缺点也很明显，花费高、步骤多，有时会 有假阳性和假阴性