RNA干扰技术 陈澄钧 16307130117 引言 RNA干扰( RNA interference,RNAi),又称转录后基因沉默(PTGS),是指将特异性同源双 链RNA( dsRNA)导入到细胞内,使目的基因的不表达或表达水平下降。该技术在2001-2002 年连续被 Science评为年度十大成就,其在医学领域上所发挥的作用可见非凡。 技术原理 在真核细胞的基因表达过程中,RNA是扮演携带并表达遗传信息的关键角色。经 由DNA转录形成的单链mRAN会与核糖体结合,并在一系列酶的辅助下,加工 形成蛋白质。而RNA技术的关键便是想办法让这mRNA发生降解使其出现基因 表达沉默的现象,即转录后基因沉默。而这个过程主要有以下部分 ①病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组 内,并利用宿主细胞进行转录时,常产生一些 dsRNA ②宿主细胞对这些异样的 dsRNA产生反应,核酸内切酶Dcer将 dsRNA切割 成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约21~23bp),即 SIRNA s「 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Or:y 3 -ho IILmmnunp-s SIRNA示意图
RNA 干扰技术 陈澄钧 16307130117 引言 RNA 干扰（RNA interference，RNAi），又称转录后基因沉默（PTGS），是指将特异性同源双 链 RNA（dsRNA）导入到细胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降。该技术在 2001-2002 年连续被 Science 评为年度十大成就，其在医学领域上所发挥的作用可见非凡。 技术原理 在真核细胞的基因表达过程中，RNA 是扮演携带并表达遗传信息的关键角色。经 由 DNA 转录形成的单链 mRAN 会与核糖体结合，并在一系列酶的辅助下，加工 形成蛋白质。而 RNAi 技术的关键便是想办法让这 mRNA 发生降解使其出现基因 表达沉默的现象，即转录后基因沉默。而这个过程主要有以下部分： ① 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组 内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些 dsRNA。 ② 宿主细胞对这些异样的 dsRNA 产生反应，核酸内切酶 Dicer 将 dsRNA 切割 成多个具有特定长度和结构的小片段 RNA（大约 21～23 bp），即 siRNA。 siRNA 示意图
③sRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链,反义sRNA再 与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复 合物(RNA- nduced silencing complex,RlsC)。 ④4RSC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合,RSC具有核酸 酶的功能,在结合部位的两端切割mRNA,使mRNA降解。 5 SIRNA还可作为引物与mRNA结合并在RNA聚合酶(RNA- dependent RNA olymerase,RdRP)作用下合成更多新的 dsRNA,新合成的 dsRNA再由 Dicer 切割产生大量的次级sRNA,从而使RNAi的作用进一步放大,最终将靶mRNA 完全降解。这样一来,便达到了基因沉默的目的。 形成21-23个碱基对的 小干扰性RNA 与蛋自结合 mRNA被降解,基因沉默出现
③ siRNA 在细胞内 RNA 解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义 siRNA 再 与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成 RNA 诱导的沉默复 合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。 ④ RISC 与外源性基因表达的 mRNA 的同源区进行特异性结合，RISC 具有核酸 酶的功能，在结合部位的两端切割 mRNA，使 mRNA 降解。 ⑤ siRNA 还可作为引物与 mRNA 结合并在 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的 dsRNA，新合成的 dsRNA 再由 Dicer 切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA 完全降解。这样一来，便达到了基因沉默的目的
技术应用 RNAi技术的应用十分广泛,在此处列举的主要是其在治疗疾病方面的作用。 RNAi技术在抗病毒上的应用 如果说要问阻碍何物的转录和表 达最为重要,病毒肯定是答案之 iot=ys 通过RNA技术,我们能够阻 止病毒的入侵、抑制病毒的复制与 转录。现如今在医学方面RNA技 术已经得到了普遍的应用,在对抗 各种病毒的战场上,如RNA病毒 Ⅳ、HCV、脊髓灰质病毒,DNA病 毒HBⅤ病毒等,都取得了极大的成效。加州大学洛杉矶分校和加州理工学院 的研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研 究小组设计合成的lent病毒载体引入 SiRNA,激发RNAi使其抑制了 Ⅳ∨-1的 coreceptor-CCR5进入人体外周T淋巴细胞,而不影响另一种 HⅣV-1主要的 coreceptor-CCR4,从而使以 lenti病毒载体为媒介引导 SIRNA进入细胞内产生了免疫应答,由此治疗HⅣ-1和其他病毒感染性疾 病的可行性大大增加 RNAi技术在肿瘤治疗上的应用 肿瘤是威胁人类生命的重大疾病之一,在肿瘤的综合治疗中,基因治疗日益 受到重视。肿瘤是一种多基因疾病,针对单个基因的基因治疗一般不能取得
技术应用 RNAi 技术的应用十分广泛，在此处列举的主要是其在治疗疾病方面的作用。 ⚫ RNAi 技术在抗病毒上的应用 如果说要问阻碍何物的转录和表 达最为重要，病毒肯定是答案之 一。通过 RNAi 技术，我们能够阻 止病毒的入侵、抑制病毒的复制与 转录。现如今在医学方面 RNAi 技 术已经得到了普遍的应用，在对抗 各种病毒的战场上，如 RNA 病毒 HIV、HCV、脊髓灰质病毒，DNA 病 毒 HBV 病毒等，都取得了极大的成效。加州大学洛杉矶分校和加州理工学院 的研究人员开发出使用 RNAi 技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研 究小组设计合成的 lenti 病毒载体引入 siRNA，激发 RNAi 使其抑制了 HIV-1 的 coreceptor-CCR5 进入人体外周Ｔ淋巴细胞，而不影响另一种 HIV-1 主要的 coreceptor-CCR4，从而使以 lenti 病毒载体为媒介引导 siRNA 进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗 HIV-1 和其他病毒感染性疾 病的可行性大大增加。 ⚫ RNAi 技术在肿瘤治疗上的应用 肿瘤是威胁人类生命的重大疾病之一，在肿瘤的综合治疗中，基因治疗日益 受到重视。肿瘤是一种多基因疾病，针对单个基因的基因治疗一般不能取得
好的效果。RNAi技术可以针对信号通路的多个基因或者基因族的共有序列 来同时抑制多个基因的表达,从而能更有效地抑制肿瘤生长。针对慢性粒细 胞白血病的融合基因设计sRNA,明显地抑制了体外培养细胞中融合基因的 表达,促进白血病细胞的凋亡。 Coca等利用粒细胞白血病细胞系研究了 Raf-1和bcl-2基因在白血病中的作用,表明RNAⅰ能诱导细胞凋亡并能提 高肿瘤细胞对化学治疗的敏感性。血管内皮生长因子vEGF)在肿瘤的发生发 展中起重要作用,已成为肿瘤治疗的新靶点。 Zhang等利用DNA表达载体 来合成鼠VEGF不同异构体的sRNA,特异性地封闭了大分子量VEGF的 表达,有效地抑制肿瘤细胞的生长。β-连环蛋白和APC基因是Wnt信号通 路中的重要组分,突变后引起细胞异常增殖,在肿瘤的发生中起重要作用。 Verma等利用RNAⅰ技术使这两个基因表达降低,在细胞和裸鼠中都能抑制 肿瘤细胞的增殖。以erbB1、端粒酶为靶点,利用RNAi技术抑制肿瘤的硏究 也取得了满意结果 ●RNAi技术在整形外科领域的应用 已证实N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因,其中66%的 病例为BRAF激酶作用域突变。而约80%的BRAF突变病例是因胸腺嘧啶突 变为腺嘌呤造成第599位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。使用RNAi技术剔除 黑素瘤细胞的BRAF表达,不仅抑制了肿瘤细胞生长,而且减弱了其侵袭能 力,为黑素瘤基因治疗奠定了基础 研究表明趋化因子受体CXCR4是乳腺癌转移的重要调节因素,其配体 CXCL12可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。使用RNAi干扰技术剔
好的效果。RNAi 技术可以针对信号通路的多个基因或者基因族的共有序列 来同时抑制多个基因的表达，从而能更有效地抑制肿瘤生长。针对慢性粒细 胞白血病的融合基因设计 siRNA ，明显地抑制了体外培养细胞中融合基因的 表达，促进白血病细胞的凋亡。Cioca 等利用粒细胞白血病细胞系研究了 Raf-1 和 bcl-2 基因在白血病中的作用，表明 RNAi 能诱导细胞凋亡并能提 高肿瘤细胞对化学治疗的敏感性。血管内皮生长因子(VEGF) 在肿瘤的发生发 展中起重要作用，已成为肿瘤治疗的新靶点。Zhang 等利用 DNA 表达载体 来合成鼠 VEGF 不同异构体的 siRNA ，特异性地封闭了大分子量 VEGF 的 表达，有效地抑制肿瘤细胞的生长。β-连环蛋白和 APC 基因是 Wnt 信号通 路中的重要组分，突变后引起细胞异常增殖，在肿瘤的发生中起重要作用。 Verma 等利用 RNAi 技术使这两个基因表达降低，在细胞和裸鼠中都能抑制 肿瘤细胞的增殖。以 erbB1、端粒酶为靶点，利用 RNAi 技术抑制肿瘤的研究 也取得了满意结果。 ⚫ RNAi 技术在整形外科领域的应用 已证实 N-Ras 或 BRAF 的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，其中 66%的 病例为 BRAF 激酶作用域突变。而约 80%的 BRAF 突变病例是因胸腺嘧啶突 变为腺嘌呤造成第 599 位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。使用 RNAi 技术剔除 黑素瘤细胞的 BRAF 表达，不仅抑制了肿瘤细胞生长，而且减弱了其侵袭能 力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。 研究表明趋化因子受体 CXCR4 是乳腺癌转移的重要调节因素，其配体 CXCL12 可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。使用 RNAi 干扰技术剔
除CXCR4证实该分子为原位移植肿瘤生长和转移所必需。此外,剔除 BCRP表达可以逆转其介导的肿瘤耐药。 技术优缺点 优点 ①RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递 和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。 ②RNAⅰ具有很高的特异性,只降解与之序列相应的单个内源基因的 mRNA,不会造成其他危害。 ③3RNAi抑制基因表达具有很高的效率,表型可以达到缺失突变体表型的程 度,而且相对很少量的 dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量) 就能完全抑制相应基因的表达,是以催化放大的方式进行的。 缺点 ① dsRNA并不能在所有生物中引起RNA应答,有些物种(如斑马鱼)可 能趋向引起非特异性致死性应答反应。 2导入 dSRNA以及sRNA的方式仍存在难点,导致技术应用的困难。 ③在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个 ATP依赖的过程;RNAi是转录水平上,其他的基因治疗都是基因组水平的 并没有改变生物体的基因组,也就是治标不治本。 ④对于含有 dsRNA的食物是否对群体或环境有什么副作用,其安全性尚需 进一步研究
除 CXCR4 证实该分子为原位移植肿瘤生长和转移所必需。此外，剔除 BCRP 表达可以逆转其介导的肿瘤耐药。 技术优缺点 ⚫ 优点： ① RNAi 抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递 和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。 ② RNAi 具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的 mRNA，不会造成其他危害。 ③ RNAi 抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程 度，而且相对很少量的 dsRNA 分子(数量远远少于内源 mRNA 的数量) 就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的。 ⚫ 缺点： ① dsRNA 并不能在所有生物中引起 RNAi 应答，有些物种（如斑马鱼）可 能趋向引起非特异性致死性应答反应。 ② 导入 dsRNA 以及 siRNA 的方式仍存在难点，导致技术应用的困难。 ③在去除 ATP 的样品中 RNA 干扰现象降低或消失显示 RNA 干扰是一个 ATP 依赖的过程；RNAi 是转录水平上，其他的基因治疗都是基因组水平的， 并没有改变生物体的基因组，也就是治标不治本。 ④对于含有 dsRNA 的食物是否对群体或环境有什么副作用，其安全性尚需 进一步研究