DNA测序技术( Sanger法测序) 黄铂琛15302010029 DNA诊断技术是应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结 构或表达水平的变化而做出的或辅助临床诊断的技术。而常用的DNA 诊断基本技术中就包括DNA测序技术。 在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的 基因的基础。目前用于测序的技术主要有双脱氧链末端终止法和化学 降解法。两者中,由 Sanger等发明的双脱氧链末端终止法得到了更 泛的应用。 Sanger法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待 定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列 测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸 三磷酸,并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸。由于双脱氧核 苷三磷酸缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性
DNA 测序技术（Sanger 法测序） 黄铂琛 15302010029 DNA 诊断技术是应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结 构或表达水平的变化而做出的或辅助临床诊断的技术。而常用的 DNA 诊断基本技术中就包括 DNA 测序技术。 在分子生物学研究中，DNA 的序列分析是进一步研究和改造目的 基因的基础。目前用于测序的技术主要有双脱氧链末端终止法和化学 降解法。两者中，由 Sanger 等发明的双脱氧链末端终止法得到了更 广泛的应用。 Sanger 法测序的原理就是利用一种 DNA 聚合酶来延伸结合在待 定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列 测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸 三磷酸，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸。由于双脱氧核 苷三磷酸缺乏延伸所需要的 3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性
地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每 种dNⅥTPs和 ddntPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至 几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的核 苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处 理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测 ddatp ddCTP ddTTP TTTTTTTTTTTTTTTTTTT DNA片段 ⊥ LLLLLLLLLLL ddA⊥L ddA⊥LLL⊥ dd A 模板DNA OACGTAAATCGATACGTAA ddAtP ddcTP ddGtP ddTTP 山L。标记引物 ①-①①CHO碱(ACG.T) DNA聚合酶 (Klenow) HH dNTP dNTP③|@-①-①-CHo碱ACG.T) 引物 DNA测序技术可应用于未知基因组的测序、全基因组重测序 深度扩展子测序和转录组测序中,能够检测关联突变,对病毒抗药性 和传染病源快速检测,测定疾病相关区域。此外,对环境基因组学和 微生物多样性,以及考古学也有广泛的应用
地在 G、A、T 或 C 处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一 种 dNTPs 和 ddNTPs 的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至 几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核 苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处 理后可用 X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 DNA 测序技术可应用于未知基因组的测序、全基因组重测序、 深度扩展子测序和转录组测序中，能够检测关联突变，对病毒抗药性 和传染病源快速检测，测定疾病相关区域。此外，对环境基因组学和 微生物多样性，以及考古学也有广泛的应用
对于 Sanger法测序来说,因测序读长长、准确性高的优点, 直占据着DNA测序技术的统治地位。该法特别适用于单基因病的基因 诊断和产前诊断。且常被用作标准的鉴定方法以及最终确定突变的确 切位点和突变性质的手段。检测的突变类型包括错义突变、无义突变、 同义突变(含SNP)、拼接突变、小缺失、小插入、大缺失、大插入 插入伴缺失、复杂重排、重复变异等,准确率100% 然而,不管是 Sanger的双脱氧链终止法还是化学裂解法,都需 要放射性同位素标记,操作繁琐且不能自动化,故无法满足大规模测 序的要求。另外,毛细管微阵列DNA测序在成本与耗时方面也远远满 足不了基因组学发展的需要。测序成本高(据估算,用该法完成人类 基因组计划,需花30亿美元),数据分析量大,自动化程度不高或需 手工操作,一些PCR产物不能被分析而需制备单克隆。诸如此类种种 原因,也阻碍了 Sanger法测序的进一步发展。 飞速发展的DNA测序技术还在帮助科学家不断地从DNA序列中挖 出更多的秘密,未来怎样难以预料。诚如人类基因组研究的知名专家、 美国塞莱拉公司首席科学家克雷格·文特尔所言:“破译基因组密码 的意义就如同在刚发现电的那个时代,没有人能想象出个人电脑、互 联网一样
对于 Sanger 法测序来说，因测序读长长、准确性高的优点，一 直占据着 DNA 测序技术的统治地位。该法特别适用于单基因病的基因 诊断和产前诊断。且常被用作标准的鉴定方法以及最终确定突变的确 切位点和突变性质的手段。检测的突变类型包括错义突变、无义突变、 同义突变(含 SNP)、拼接突变、小缺失、小插入、大缺失、大插入、 插入伴缺失、复杂重排、重复变异等，准确率 100%。 然而，不管是 Sanger 的双脱氧链终止法还是化学裂解法，都需 要放射性同位素标记，操作繁琐且不能自动化，故无法满足大规模测 序的要求。另外，毛细管微阵列 DNA 测序在成本与耗时方面也远远满 足不了基因组学发展的需要。测序成本高(据估算，用该法完成人类 基因组计划，需花 30 亿美元)，数据分析量大，自动化程度不高或需 手工操作，一些 PCR 产物不能被分析而需制备单克隆。诸如此类种种 原因，也阻碍了 Sanger 法测序的进一步发展。 飞速发展的 DNA 测序技术还在帮助科学家不断地从 DNA 序列中挖 出更多的秘密，未来怎样难以预料。诚如人类基因组研究的知名专家、 美国塞莱拉公司首席科学家克雷格·文特尔所言： “破译基因组密码 的意义就如同在刚发现电的那个时代，没有人能想象出个人电脑、互 联网一样
