源源不断的胰岛 —转基因技术的奇迹 制作人:改变生活的生物技术周二11,12节核科学系张誉戈16300200038 专题:生物技术在病中的应用 1.世界呼呼胰岛素 胰岛素是由胰脏内的胰尿病流行的全球趋势 岛β细胞受内源性或外源性 2007-2025(百万 物质如葡萄糖、乳糖、核糖、 423 53.2 精氨酸、胰高血糖素等的刺 64.1 245 40.5 44.5 81% 激而分泌的一种蛋白质激 m 素。胰岛素是机体内唯一降 32 187 03 102% 73% 低血糖的激素,同时促进糖 World 2007=246 million 2025=380 million 原、脂肪、蛋白质合成。外 Increase 55% 源性胰岛素主要用来糖尿 病治疗 在胰岛素发现以前,糖尿病是一种绝症:生长发育停顿,在一次次 酮症酸中毒中死亡。 随着糖尿病患病人数 胰岛素的发展史 的增加,人类对胰岛素 的需求越来越大 1996胰岛素类似物 1987人胰岛素 2.胰岛素的早期生产 1973单组分胰岛素 1953长效胰岛素 1938 NPH 1923动物胰岛素 192019301940195019601970198019902000
——转基因技术的奇迹 制作人：改变生活的生物技术周二 11,12 节 核科学系张誉戈 16300200038 专题：生物技术在病中的应用 1. 世界呼呼胰岛素 胰岛素是由胰脏内的胰 岛β细胞受内源性或外源性 物质如葡萄糖、乳糖、核糖、 精氨酸、胰高血糖素等的刺 激而分泌的一种蛋白质激 素。胰岛素是机体内唯一降 低血糖的激素，同时促进糖 原、脂肪、蛋白质合成。外 源性胰岛素主要用来糖尿 病治疗。 在胰岛素发现以前，糖尿病是一种绝症：生长发育停顿，在一次次 酮症酸中毒中死亡。 随着糖尿病患病人数 的增加，人类对胰岛素 的需求越来越大。 2. 胰岛素的早期生产：
问题多多! 1.数量不足,无法满足临床应用 2.作用时间短,需要频繁注射 3.酸性溶液,导致注射疼痛 4.制剂不纯形成囊肿和免疫反应 3.基因工程来了! 1.提取目的基因 既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因 从原DNA中分离 1.鸟枪法:用一大堆限制性核酸內切酶对附近基因进行剪切,再提取 所需要的。至于如何筛选,用DNA分子杂交,即DNA探针 2.人工合成法:根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列,然后人 工合成,没有内含子 3从基因文库中提取:也就是事先已经提取完毕的拿来用 4.PCR扩增技术:用于大量生产该段基因片段,用于商业化运作
问题多多！ 1. 数量不足，无法满足临床应用 2. 作用时间短，需要频繁注射 3. 酸性溶液，导致注射疼痛 4. 制剂不纯形成囊肿和免疫反应 3. 基因工程来了！ 1. 提取目的基因 既从人的 DNA 中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因 从原 DNA 中分离。 1.鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取 所需要的。至于如何筛选，用 DNA 分子杂交，即 DNA 探针 2.人工合成法：根据转录蛋白或者 mRNA 推导出基因序列，然后人 工合成，没有内含子 3.从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用 4.PCR 扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作
2提取质粒 从大肠杆菌的细胞质中提取质粒质粒为环状 此质粒将作为胰岛素基因的载体。 1碱裂解法:此方法适用于小量质粒DNA的提取,提取的质粒DNA 可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。 2煮沸法 3基因重组 取出目的基因与质粒先利用同种限制性内切酶将质粒切开再使用 DNA连接酶将目的基因与质粒“缝合”,形成一个能表达出胰岛素的 DNA质粒。 4.将质粒送回大肠杆菌 在大肠杄菌的培养液中加入含有Ca'的物质如CaC2,这使细胞收 外源基因此时将重组的质粒也放入培养液中大肠杆菌便会将重 组质粒吸收.将大肠杄菌用氯化钙处理,以增大大肠杄菌细胞壁的 通透性,使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞,此时的 细胞处于感受态(理化方法诱导细胞,使其处于最适摄取和容纳 外来DNA的生理状态)
2.提取质粒 从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状。 此质粒将作为胰岛素基因的载体。 1.碱裂解法：此方法适用于小量质粒 DNA 的提取，提取的质粒 DNA 可直接用于酶切、PCR 扩增、银染序列分析。 2.煮沸法 3.基因重组 取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用 DNA 连接酶将目的基因与质粒“缝合”,形成一个能表达出胰岛素的 DNA 质粒。 4. 将质粒送回大肠杆菌 在大肠杆菌的培养液中加入含有 Ca +的物质,如 CaCl2,这使细胞收 外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重 组质粒吸收. 将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的 通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的 细胞处于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳 外 来 DNA 的 生 理 状 态 ）
人胰岛素示意图 5.胰岛素的产生 在大肠杆菌内质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白 质通过大肠杄菌的大量繁衍便可大量生产出胰岛素!注意:大肠杆 菌产出的是多肽链,因为原核生物没有内质网、高尔基体等,不能进 行多肽的折叠、修饰等,还需人为进行菌体外加工
5. 胰岛素的产生 在大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白 质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素! 注意：大肠杆 菌产出的是多肽链，因为原核生物没有内质网、高尔基体等，不能进 行多肽的折叠、修饰等，还需人为进行菌体外加工