免疫酶技术 刘昱宏14340220005 技术原理及特点 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化 用有机结合的一种方法。它以酶作为标记物,与抗体或 抗原抗体反应的特异性 抗原联结,与相应的抗原或抗体作用 过底物的颜 反应作抗原抗体的定性和定量,亦可用于组织中抗原或 体的定位,定性或定量研究,即酶免疫组织化学技术 该技术有灵敏度高,特异性强,准确性好的特点,酶标 酶高效锥化反应的专一性 记能够较长时间保持稳定,操作简便对环境无污染。并且 易于其他技术联系衍生出适用范围更广的新方法。 主要试剂 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点 技术分类介绍 疫学活性 酶免疫技术分为酶免疫组化(组织接片或其它标本中 酶对底物的催化活性 定量),其中酶免疫测定分为均相酶免疫测定与非 免疫测定。 1.均相酶免疫测定:用于小分子激素和半抗原的测定。最具代表性的两种技术为酶放大免疫测定技 术(EMT)与克隆酶供体免疫分析(CED|A)。 2非均相酶免疫测定:与均相不同之处在于需要分离有利于结合的酶标记。分为液相与固相酶免疫 测定。以聚苯乙烯等作为固相载体的酶联免疫吸附试验(EL丨SA)是目前最为常用的固相酶免疫测 三.酶联免疫吸附试验(EL丨SA) 作为酶免疫测定技 术中应用最广的技术。 Capture/Sandwich Direct 其基本方法是将已知的 抗原或抗体吸附在固相 载体(聚苯乙烯微量反 应板)表面,使酶标记 的抗原抗体反应在固相 液相中的游离成分洗除 常用的ELSA法有双de 抗体夹心法和间接法 Primary Ab Bound 刖 者用于检测大分子抗 原,后者用于测定特异 抗体 双抗体夹心法:用一只抗体包被,加入待检血清,再加酶标记抗体,加底物显色。应用于二价或 价以上大分子抗原测定(甲胎蛋白等)。一般之操作步骤为 将具有专一性之抗体固著( coating)于塑胶孔盘上,完成后洗去多余抗体 加入待测检体,检体中若含有待测之抗原,则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结 洗去多余待测检体,加入另一种对抗原专一之一次抗体,与待测抗原进行键结 洗去多余未键结一次抗体,加入带有酵素之二次抗体,与一次抗体键结 待测抗原 洗
免疫酶技术 刘昱宏 14340220005 ⼀.技术原理及特点 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的⾼效催化 作⽤有机结合的⼀种⽅法。它以酶作为标记物，与抗体或 抗原联结，与相应的抗原或抗体作⽤后，通过底物的颜⾊ 反应作抗原抗体的定性和定量，亦可⽤于组织中抗原或抗 体的定位，定性或定量研究，即酶免疫组织化学技术。 该技术有灵敏度⾼，特异性强，准确性好的特点，酶标 记能够较⻓时间保持稳定，操作简便对环境⽆污染。并且 易于其他技术联系衍⽣出适⽤范围更⼲的新⽅法。 ⼆.技术分类介绍 酶免疫技术分为酶免疫组化（组织接⽚或其它标本中的抗 原定位）与酶免疫测定（液体标本中抗原或抗体的定性预 定量），其中酶免疫测定分为均相酶免疫测定与⾮均相酶 免疫测定。 1.均相酶免疫测定：⽤于⼩分⼦激素和半抗原的测定。最具代表性的两种技术为酶放⼤免疫测定技 术（EMIT）与克隆酶供体免疫分析（CEDIA）。 2.⾮均相酶免疫测定：与均相不同之处在于需要分离有利于结合的酶标记。分为液相与固相酶免疫 测定。以聚苯⼄烯等作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是⺫前最为常⽤的固相酶免疫测 定。 三. 酶联免疫吸附试验（ELISA） 作为酶免疫测定技 术中应⽤最⼲的技术。 其基本⽅法是将已知的 抗原或抗体吸附在固相 载体 ( 聚苯⼄烯微量反 应板 ) 表⾯，使酶标记 的抗原抗体反应在固相 表⾯进⾏，⽤洗涤法将 液相中的游离成分洗除。 常⽤的 ELISA 法有双 抗体夹⼼法和间接法， 前者⽤于检测⼤分⼦抗 原，后者⽤于测定特异 抗体。 1.双抗体夹⼼法：⽤⼀只抗体包被，加⼊待检⾎清，再加酶标记抗体，加底物显⾊。应⽤于⼆价或 ⼆价以上⼤分⼦抗原测定（甲胎蛋⽩等）。⼀般之操作步骤为： 将具有专⼀性之抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 加⼊待测检体，检体中若含有待测之抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进⾏专⼀性键结 洗去多余待测检体，加⼊另⼀种对抗原专⼀之⼀次抗体，与待测抗原进⾏键结 洗去多余未键结⼀次抗体，加⼊带有酵素之⼆次抗体，与⼀次抗体键结
洗去多余未键结二次抗体,加入酵素受质使酵素呈色,以肉眼或仪器读取呈色结果 1、已知抗体包 1、已知抗体包 被于载体表面 被于载体表面 2、加待检物 2、加待检物无抗 ◆令◆抗原与抗体结合 原与抗体结合 洗涤 厂3如标执体 3、加酶标抗体 与抗原结合 无抗原结合 洗涤 洗涤 G「4加酶作用的底物 4、加酶作用的底物 ◆◆◆ 产生色 不产生颜色 双抗体夹心法测抗原 2间接法:用一只抗原包被,加入待测血清,再加入酶标记的抗体,加底物显色。常用于HV抗体和 梅毒螺旋体抗体等的测定。 1.包被抗原 抗原 2洗涤 06666 稀释度 3加待检抗体 ●-|16 抗体 4.洗涤 5加酶标抗体 128 齬标抗体 6洗涤 512 1024 7加底物显色 底物9。●99999甲性对服 羽性对私 8观察结果 酶联免疫吸附试验(ELSA,间接法)
洗去多余未键结⼆次抗体，加⼊酵素受质使酵素呈⾊，以⾁眼或仪器读取呈⾊结果 2.间接法：⽤⼀只抗原包被，加⼊待测⾎清，再加⼊酶标记的抗体，加底物显⾊。常⽤于HIV抗体和 梅毒螺旋体抗体等的测定
三酶免疫测定的应用 均相酶免疫测定主要用于药物与小分子物质的检测。 非均相免疫测定中的ELA应用更为广泛,ELSA广泛用于传染病的诊断,病毒图病毒性甲肝(甲肝 抗体,“乙肝三对”,丙肝抗体,丁肝抗体,戊肝抗体),风疹病毒,疱疹病毒,轮状病毒顶:细菌如 结核杄菌,幽门螺旋杄菌等。也用于一些蛋白质检测,如过重免一切蛋白,补体,肿瘤标志物(甲 胎蛋白,癌胚抗原,前列腺特异型抗原等)。 EL|SA试剂盒 酶标仪
三.酶免疫测定的应⽤ 均相酶免疫测定主要⽤于药物与⼩分⼦物质的检测。 ⾮均相免疫测定中的ELISA应⽤更为⼲泛，ELISA⼲泛⽤于传染病的诊断，病毒图病毒性甲肝（甲肝 抗体，“⼄肝三对”，丙肝抗体，丁肝抗体，戊肝抗体），⻛疹病毒，疱疹病毒，轮状病毒顶：细菌如 结核杆菌，幽⻔螺旋杆菌等。也⽤于⼀些蛋⽩质检测，如过重免⼀切蛋⽩，补体，肿瘤标志物（甲 胎蛋⽩，癌胚抗原，前列腺特异型抗原等）。 ELISA试剂盒 酶标仪