酶联免疫吸附测定法 13307130142徐涣霖 、概述 1971年瑞典的 Engval1等人分别以纤维素和聚苯乙烯试管作为固相载体 吸附抗原/抗体,建立了酶联免疫吸附测定( Enzyme linked Immunosorbent Assay, 简称 ELISA),后来人们改用板式反应孔进行 ELISA,大大地提高了实验通量 ELISA实验具有极高的灵活性,实际操作中人们可以根据自己的需要以及手上已 有的材料进行灵活的组合而进行各种可样的 ELISA进行反应测定,另外 ELISA 实验中的相关试剂和耗材都已经商品化,所以 ELISA被广泛地应用于生物学的 各种研究中。 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载 体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学 活性,又保留酶的活性。在测定时,受检标本(测定抗体或抗原)与固相载体表面的 抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体 中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体 上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物 后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故 可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了 免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度 、原理图解 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。使抗原或抗体结合到某种固相 载体表面,并保持其免疫活性。 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留 其免疫活性,又保留酶的活性结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成 一定的比例。 测定时,受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应,洗涤加入酶标记抗 原或抗体,加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本
酶联免疫吸附测定法 13307130142 徐涣霖 一、概述 1971 年瑞典的 Engvall 等人分别以纤维素和聚苯乙烯试管作为固相载体 吸附抗原/抗体,建立了酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosrbent Assay, 简称 ELISA),后来人们改用板式反应孔进行 ELISA,大大地提高了实验通量。 ELISA 实验具有极高的灵活性,实际操作中人们可以根据自己的需要以及手上已 有的材料进行灵活的组合而进行各种可样的 ELISA 进行反应测定,另外 ELISA 实验中的相关试剂和耗材都已经商品化,所以 ELISA 被广泛地应用于 生物学的 各种研究中。 ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载 体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学 活性,又保留酶的活性。在测定时,受检标本(测定抗体或抗原)与固相载体表面的 抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体 复合物与液体 中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体 上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物 后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物 质的量直接相关,故 可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了 免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。 二、原理图解 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。使抗原或抗体结合到某种固相 载体表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留 其免疫活性，又保留酶的活性结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成 一定的比例。 测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应，洗涤加入酶标记抗 原或抗体，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本
中受检物质的量直接相关,由此进行定性或定量分析 1、双抗体夹心法测抗原 待测抗原须有两个可以与抗体结合的部位,其一端与包被于固相载体上的抗 体结合,另一端与酶标记的特异性抗体结合, 89 加底物显色 酶标抗体 特异性抗体 双恍体夹心法刻定抗原 2、双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似。 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体
中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 1、双抗体夹心法测抗原 待测抗原须有两个可以与抗体结合的部位，其一端与包被于固相载体上的抗 体结合，另一端与酶标记的特异性抗体结合。 2、双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似。 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体
固相抗原待检抗体 标抗 3、间接法测抗体 利用酶标记的抗体检测已与固相结合的受检抗体,故称为间接法。本法主要 用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗体检测相应抗体。 间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注意除去能与一般健康人血清发 生反应的杂质。若抗原中含有无关蛋白,也会因竟争吸附而影响包被效果。 人人 待检抗体 醇标记的抗体 + 固相抗原 人 加底物 间接法测定抗体示意图 显色 4、竞争法测抗体
3、间接法测抗体 利用酶标记的抗体检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。本法主要 用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗体检测相应抗体。 间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注意除去能与一般健康人血清发 生反应的杂质。若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。 4、竞争法测抗体
8 令待检抗原 8 酶标记的抗体 3 加底物 色 YYYY固相抗体 88 酶标记的抗原 加底物 显色 YYYY 固相抗体 三、应用实例 检测乙型肝炎核心抗原 乙肝两对半又称乙肝五项,为国内常用的乙肝病毒(HBV)感染的检测血清标 志物。乙肝病毒免疫学标记有表面抗原(HsAg)、表面抗体(抗HBs或 HBsAb)、e 抗原( HBeAg)和e抗体(抗-HBe或邗BeAb)、核心抗原( HBcAg)和核心抗体(抗-HBc 或HcAb)”。可检测患者是否感染乙肝及感染的具体情况。随着现代临床免疫学 的发展,酶联免疫吸附试验( ELISA)因其操作简单、灵敏度高、特异性髙等特点 而广泛应用于乙肝五项的检测 四、技术优点与缺点 优点: 操作简单、快速、敏感性高、特异性强、实验设备要求简单、应用范围广泛、无 放射性污染、能定性及半微量、微量、超微量定量分析。 可重复性不好;收自身抗体、嗜异性抗体等干扰,易出现假阳性;不论仪器和手 工操作,干扰因素较多,影响最大的是温度和时间
三、应用实例 检测乙型肝炎核心抗原 乙肝两对半又称乙肝五项 ，为国内常用的乙肝病毒(HBV)感染的检测血清标 志物。乙肝病毒免疫学标记有表面抗原(HBsAg)、表面抗体(抗-HBs 或 HBsAb)、e 抗原(HBeAg)和 e 抗体(抗-HBe 或 HBeAb)、核心抗原(HBcAg)和核心抗体(抗-HBc 或 HBcAb)”。可检测患者是否感染乙肝及感染的具体情况。随着现代临床免疫学 的发展，酶联免疫吸附试验(ELISA) 因其操作简单、灵敏度高、特异性高等特点 而广泛应用于乙肝五项的检测。 四、技术优点与缺点 优点： 操作简单、快速、敏感性高、特异性强、实验设备要求简单、应用范围广泛、无 放射性污染、能定性及半微量、微量、超微量定量分析。 缺点： 可重复性不好；收自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性；不论仪器和手 工操作，干扰因素较多，影响最大的是温度和时间