第二章 基因工程的载体 和工具酶 第一节载体
1 第二章 基因工程的载体 和工具酶 第一节 载体
引言 基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到 扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表 达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就 必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实留 作为基因克隆的载体必须具备以下特性： (1)载体必须是复制子。 (2)具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 (3)具备多克隆位点(MCS),便于外源基因插入。 (4)自身分子量较小，拷贝数高。 (⑤)在宿主细胞内稳定性高。 2
2 引 言 基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到 扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表 达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就 必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。 作为基因克隆的载体必须具备以下特性： ⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高
Characteristics of vectorsfor gene cloning Foreign gene MCS Marker
3 Characteristics of vectors for gene cloning MCS Marker Foreign gene
一、 质粒载体 (plasimid vectors) (一)质粒载体的生物学特性 (二)质粒载体的制备 (三)质粒载体的改造 4
4 一 、 质粒载体 （plasimid vectors） （一）质粒载体的生物学特性 （二）质粒载体的制备 （三）质粒载体的改造
(一)质粒的生物学特性 (1)质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露 的双链环状（少数为线形和RNA) DNA分子。 广泛从在于细菌细胞 中，比病毒更简单。 bacterium 在霉菌、蓝藻、酵母 和一些动植物细胞中 plasmid 也发现了质粒，目前 bacterial chromosome 对细菌的质粒研究得 比较深入，特别是大 肠杆菌的质粒。大肠杆 菌的质粒主要有F质粒( 因子)、R质粒（抗药性 因子)和Col质粒（大肠 杆菌素因子)三种。 1um
5 （一）质粒的生物学特性 （1）质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露 的双链环状(少数为线形和RNA） DNA分子。 广泛从在于细菌细胞 中，比病毒更简单。 在霉菌、蓝藻、酵母 和一些动植物细胞中 也发现了质粒，目前 对细菌的质粒研究得 比较深入，特别是大 肠杆菌的质粒。大肠杆 菌的质粒主要有F质粒（F 因子）、R质粒（抗药性 因子）和Col质粒（大肠 杆菌素因子）三种
(一)质粒的生物学特性 (2) 质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只 能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的 达到200kb。 (3)质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借 居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质 粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起 点不一定能在其它生物细胞中繁殖。有的可 以在两种宿主中穿梭，可以构建出“穿梭载 体
6 （一）质粒的生物学特性 （2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只 能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的 达到200kb。 （3）质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借 居” ，离开了寄主它本身无法复制；同时质 粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起 点不一定能在其它生物细胞中繁殖。有的可 以在两种宿主中穿梭，可以构建出“穿梭载 体”
(一)质粒的生物学特性 (4)质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存 在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为 两种复制型：“严紧型”质粒(stigent plasmid) 拷贝数为l-3;“松弛型”质粒(relaxed plasmid), 拷贝数为1060。不过即使是同一质粒，其拷贝数在不 同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变 化。 (5)质粒的不亲和性两种亲缘关系密切的不同 质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。载体质粒与受 体的质粒应是不同的不亲和群
7 （一）质粒的生物学特性 （4）质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存 在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为 两种复制型： “严紧型”质粒（stigent plasmid）, 拷贝数为1-3； “松弛型”质粒（relaxed plasmid）, 拷贝数为10-60。不过即使是同一质粒，其拷贝数在不 同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变 化。 （5）质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同 质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。载体质粒与受 体的质粒应是不同的不亲和群
(一)质粒的生物学特性 (6) 质粒的转移 转移性质粒，含有tra基因；能通过结合 是否含有接 作用从一个细胞转移到另一个细胞。 合转移基因 非转移性质粒，不含a基因；可以为转 移性质粒所带动转移。 在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间 有一定的相关性。现归纳如下： 接合型质粒 非接合型质粒 分子量大 分子量小 严紧型复制 松弛型复制 8
8 （一）质粒的生物学特性 ⑹ 质粒的转移 接合型质粒 分子量大 严紧型复制 非接合型质粒 分子量小 松弛型复制 是否含有接 合转移基因 非转移性质粒，不含tra基因；可以为转 移性质粒所带动转移。 转移性质粒，含有tra基因；能通过结合 作用从一个细胞转移到另一个细胞。 在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间 有一定的相关性。现归纳如下：
(一)质粒的生物学特性 (7)质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和 线状双螺旋三种， 5A0330A000R090061 双螺旋共价闭合 开环双螺旋 线状双螺旋 环(SC构型) (0C构型) (构型)
9 （一）质粒的生物学特性 （7）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和 线状双螺旋三种， 双螺旋共价闭合 环（SC构型） 开环双螺旋 （OC构型） 线状双螺旋 （L构型）
质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图 由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此， 在紫外线照射下DNA电泳条带呈橘黄色。 (a)道中的SC DNA走在凝胶的最前沿， OC DNA则位于凝胶的最后边：(b)道中 的LDNA是经核酸内切限制酶切割质粒 之后产生的，它在凝胶中的位置介于 OC DNA和SC DNA之间
10