实验十一 蛋白质含量的测定
实验十一 蛋白质含量的测定
一、目的要求 1.学习和掌握蛋白质含量测定的原理 2.掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度的操 作技术 二、原理
一、目的要求 1.学习和掌握蛋白质含量测定的原理 2.掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度的操 作技术 二、原理
微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨， 氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强 碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏 法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进 行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品 中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的 含氮量。 因为蛋白质含氮量通常在16 %左右，所以将凯氏定 氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的 蛋白质含量
微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨， 氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强 碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏 法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进 行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品 中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的 含氮量。 因为蛋白质含氮量通常在16 %左右，所以将凯氏定 氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的 蛋白质含量
Folin—酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓 度 蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此 有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合 物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进 Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合 物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在 一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本 法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵 敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处 是此反应受多种因素干扰
Folin—酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓 度 蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此 有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合 物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进 Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合 物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在 一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本 法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵 敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处 是此反应受多种因素干扰
紫外分光光度法测定蛋白质浓度 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有 共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸 收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质 溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用 作定量测定。 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简 便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定
紫外分光光度法测定蛋白质浓度 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有 共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸 收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质 溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用 作定量测定。 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简 便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定
总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉） •准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－ 2000μg/ml ； Micro BCA 试 剂 测 定 范 围 是 0.5- 20μg/ml •快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快 4倍而且更加方便 •经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行， 大大节约样品和试剂用量 •不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 •检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮 蓝
总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉） •准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－ 2000μg/ml ； Micro BCA 试 剂 测 定 范 围 是 0.5- 20μg/ml •快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快 4倍而且更加方便 •经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行， 大大节约样品和试剂用量 •不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 •检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮 蓝
基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+ ， Cu+与BCA 试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的 吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白 的浓度
基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+ ， Cu+与BCA 试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的 吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白 的浓度
BCA蛋白质检测流程：
BCA蛋白质检测流程：
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白 质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过 测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与 其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰 物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白 质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过 测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与 其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰 物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）
Coomassie Dye-Based 蛋白质定量 PROTEIN + Amax = 595nm BLUE Acid Coomassie G-250 Protein - Dye Complex O CH2CH3 NH C CH3 CH3 N CH2 SO3 - CH3CH2 N CH2 CH2CH3 SO3Na +
Coomassie Dye-Based 蛋白质定量 PROTEIN + Amax = 595nm BLUE Acid Coomassie G-250 Protein - Dye Complex O CH2CH3 NH C CH3 CH3 N CH2 SO3 - CH3CH2 N CH2 CH2CH3 SO3Na +