裁反应(PCR)技术
一．实验目的及背景 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８ ０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此 法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的Ｄ ＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间， 但它已迅速 渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命， 目前它在分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学， 考古学等方面得到了广泛的应用。 ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ， 引物和４种脱氧核苷酸存在 的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异 性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。 反应分三步：①变性 （denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（ex tension）， 反应过程见图
一．实验目的及背景 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８ ０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此 法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的Ｄ ＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间， 但它已迅速 渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命， 目前它在分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学， 考古学等方面得到了广泛的应用。 ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ， 引物和４种脱氧核苷酸存在 的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异 性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。 反应分三步：①变性 （denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（ex tension）， 反应过程见图
模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链； 在５５℃ 条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同 源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ聚合酶Taq 酶催 化下， 在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一 次循环。 接着又以新合成的ＤＮＡ为模板进行同样反 应，如次往复循环３０次，由于每次循环目标ＤＮＡ 都以２n次幂扩增，３０次循环后目的DNA的量增加１ ０６－７倍。成功的ＰＣＲ反应要求反应有很好的特异 性，和相当的扩增效率。 要达此目的ＰＣＲ反应要注 意以下问题：
模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链； 在５５℃ 条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同 源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ聚合酶Taq 酶催 化下， 在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一 次循环。 接着又以新合成的ＤＮＡ为模板进行同样反 应，如次往复循环３０次，由于每次循环目标ＤＮＡ 都以２n次幂扩增，３０次循环后目的DNA的量增加１ ０６－７倍。成功的ＰＣＲ反应要求反应有很好的特异 性，和相当的扩增效率。 要达此目的ＰＣＲ反应要注 意以下问题：
１．ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ ng左右。且ＤＮＡ纯度较高， 以增加反应特异性。 ２．dNTP:反应体系中达100μM～200μM。 ３．Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右， 浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。 ４．引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约 20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40 ％－70％之间；引物内 部不能有回该序列；引物３’端不能互补。 ５．Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚 合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力
１．ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ ng左右。且ＤＮＡ纯度较高， 以增加反应特异性。 ２．dNTP:反应体系中达100μM～200μM。 ３．Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右， 浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。 ４．引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约 20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40 ％－70％之间；引物内 部不能有回该序列；引物３’端不能互补。 ５．Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚 合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力
６．变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。 ７．复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板 和引物配对结合强弱而定， 它是反应特异性的决定因 素。 ８．延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应 温度
６．变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。 ７．复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板 和引物配对结合强弱而定， 它是反应特异性的决定因 素。 ８．延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应 温度
二．实验试剂及仪器 １０×buffer: 500mM KCl 100mM Tris-HCl (pH9.0) 0.1% 明胶 1% TritonX-100 MgCl2 2.5mM ４×dNTP: 1mM 引物：TGGCCGAGCTG 5.0uM 模板： 20ng/μl Taq酶： 5u/μl PCR仪，凝胶成像系统，电泳系统
二．实验试剂及仪器 １０×buffer: 500mM KCl 100mM Tris-HCl (pH9.0) 0.1% 明胶 1% TritonX-100 MgCl2 2.5mM ４×dNTP: 1mM 引物：TGGCCGAGCTG 5.0uM 模板： 20ng/μl Taq酶： 5u/μl PCR仪，凝胶成像系统，电泳系统
三. 实验方法 １．向无菌的500μl Eppendorf管中依次加入以下溶液。 反应物 体积 10×buffer 2.5μl 4×dNTP(1mM) 2.5μl MgCl2 (25mM) 2.5μl 无菌水 10.5μl Taq酶 (1U/ul) 1μl 引物 2μl 模板ＤＮＡ (20ng) 4μl 总体积 25μl
三. 实验方法 １．向无菌的500μl Eppendorf管中依次加入以下溶液。 反应物 体积 10×buffer 2.5μl 4×dNTP(1mM) 2.5μl MgCl2 (25mM) 2.5μl 无菌水 10.5μl Taq酶 (1U/ul) 1μl 引物 2μl 模板ＤＮＡ (20ng) 4μl 总体积 25μl
2．反应体系混匀，离心 3．在ＰＣＲ仪上按以下方式循环 ９4℃变性 １分钟 36℃退火 １分钟 72℃延伸 ２分钟 经过40个循环 4．７２℃延伸反应7分钟。 5．取20μl反应液加4μl Loading buffer在 6.１．５％琼脂糖凝胶上120伏，电泳2小时。 7. 在凝胶成像系统上观察记录实验结
2．反应体系混匀，离心 3．在ＰＣＲ仪上按以下方式循环 ９4℃变性 １分钟 36℃退火 １分钟 72℃延伸 ２分钟 经过40个循环 4．７２℃延伸反应7分钟。 5．取20μl反应液加4μl Loading buffer在 6.１．５％琼脂糖凝胶上120伏，电泳2小时。 7. 在凝胶成像系统上观察记录实验结
四. 结果分析 １．记录实验结果，并估测ＰＣＲ扩增 产物分子量。 问题与讨论： １．简述ＰＣＲ基本原理 ２．进行一次成功的ＰＣＲ反应顺注意 哪些问题
四. 结果分析 １．记录实验结果，并估测ＰＣＲ扩增 产物分子量。 问题与讨论： １．简述ＰＣＲ基本原理 ２．进行一次成功的ＰＣＲ反应顺注意 哪些问题