实验六 细胞色素C（Cytc）的 制备
实验六 细胞色素C（Cytc）的 制备
一、目的要求 1.学习蛋白质制备的基本原理及方法。 2.学习和掌握制备细胞色素C的方法
一、目的要求 1.学习蛋白质制备的基本原理及方法。 2.学习和掌握制备细胞色素C的方法
二、原理 细胞色素C存在于线粒体中，是唯一较容易从线粒体 中提前出来的蛋白质。先向心肌中加入低浓度三氯乙 酸溶液（TCA），一起匀浆，由于细胞色素C是碱性 蛋白，低浓度的TCA可使其酸化，易于从膜上溶解下 来，而其它的大部分蛋白质都被TCA沉淀下来。再通 过硫酸铵沉淀肌红蛋白，最后用较高浓度的TCA使细 胞色素C沉淀出来，达到初步纯化的目的
二、原理 细胞色素C存在于线粒体中，是唯一较容易从线粒体 中提前出来的蛋白质。先向心肌中加入低浓度三氯乙 酸溶液（TCA），一起匀浆，由于细胞色素C是碱性 蛋白，低浓度的TCA可使其酸化，易于从膜上溶解下 来，而其它的大部分蛋白质都被TCA沉淀下来。再通 过硫酸铵沉淀肌红蛋白，最后用较高浓度的TCA使细 胞色素C沉淀出来，达到初步纯化的目的
三、材料、试剂与器材 材料：猪心 试剂： 20% TCA、 0.145 mol/L TCA、硫酸铵、10% NaOH 器材：组织捣碎机 、离心机、磁力搅拌器
三、材料、试剂与器材 材料：猪心 试剂： 20% TCA、 0.145 mol/L TCA、硫酸铵、10% NaOH 器材：组织捣碎机 、离心机、磁力搅拌器
四、离心机的使用 (1).离心机要置水平位置,以保证旋转轴垂直地球水平面。 (2).使用前应检查套环是否平衡。 (3).离心杯及其外套(离心管套)是否平衡。 (4).样品倾入离心杯后应与离心管套一起两两平衡，平 衡后把它们放置于转子的对称位置。 (5).盖好盖子,打开电源开关,调整离心时间。 (6).启动离心时转速应由小至大,缓慢升速(一般要 2~3min)。 (7).达到预定转速后再调整离心时间至预定时间。 (8).离心完成后要调整调速连杆至零位,同时关上电源。 (9).要等到转速为零时才能打开离心机盖,取出样品
四、离心机的使用 (1).离心机要置水平位置,以保证旋转轴垂直地球水平面。 (2).使用前应检查套环是否平衡。 (3).离心杯及其外套(离心管套)是否平衡。 (4).样品倾入离心杯后应与离心管套一起两两平衡，平 衡后把它们放置于转子的对称位置。 (5).盖好盖子,打开电源开关,调整离心时间。 (6).启动离心时转速应由小至大,缓慢升速(一般要 2~3min)。 (7).达到预定转速后再调整离心时间至预定时间。 (8).离心完成后要调整调速连杆至零位,同时关上电源。 (9).要等到转速为零时才能打开离心机盖,取出样品
五、操作方法 1. 新鲜猪心50 g，切碎，加等量0.145 mol/L TCA，高 速组织捣碎机匀浆2min。使cytc从线粒体膜上解聚 下来。 2. 用6层纱布过滤匀浆液去杂质。并于室温放置抽提3 小时。 3. 用10％ NaOH溶液将上述混合液调pH值至7.3，并 测定体积。 ——以利于（NH4）2SO4沉淀去杂蛋白 4. 按500 g/L混合液缓慢加入（NH4）2SO4粉末，边加 边搅拌。放置一段时间，4000 r/m离心20 min去除 沉淀，得到粉红色滤液，测定体积。 5. 进一步按50 g/L滤液缓慢加入（NH4）2SO4粉末， 边加边搅拌。放置一段时间，4000 r/m离心20 min 去除沉淀，得到粉红色滤液，测定体积。 6. 加 入 20%TCA （ 25 mol/L 上 清 ） — 沉 淀 cytc 。 3000r/m离心15 min得到沉淀
五、操作方法 1. 新鲜猪心50 g，切碎，加等量0.145 mol/L TCA，高 速组织捣碎机匀浆2min。使cytc从线粒体膜上解聚 下来。 2. 用6层纱布过滤匀浆液去杂质。并于室温放置抽提3 小时。 3. 用10％ NaOH溶液将上述混合液调pH值至7.3，并 测定体积。 ——以利于（NH4）2SO4沉淀去杂蛋白 4. 按500 g/L混合液缓慢加入（NH4）2SO4粉末，边加 边搅拌。放置一段时间，4000 r/m离心20 min去除 沉淀，得到粉红色滤液，测定体积。 5. 进一步按50 g/L滤液缓慢加入（NH4）2SO4粉末， 边加边搅拌。放置一段时间，4000 r/m离心20 min 去除沉淀，得到粉红色滤液，测定体积。 6. 加 入 20%TCA （ 25 mol/L 上 清 ） — 沉 淀 cytc 。 3000r/m离心15 min得到沉淀
7.用1 mL蒸馏水溶解沉淀，将此悬浮液移入透析袋， 透析至无（NH4）2SO4和TCA。 8.透析后的细胞色素C溶液4000 r/min离心20 min去 除沉淀，得到粉红色滤液。 六、注意事项 1.加入（NH4）2SO4时要先将其磨成粉末，再缓慢地 边搅拌边加入。 2. 10％NaOH溶液调混合液pH值至7.3时，一定不能 调过头，否则细胞色素C易变性。 3.透析时要求低温，透析袋要避免破漏，每隔几小时 要换透析液，并用Ba2+检查是否还有SO4 2－存在
7.用1 mL蒸馏水溶解沉淀，将此悬浮液移入透析袋， 透析至无（NH4）2SO4和TCA。 8.透析后的细胞色素C溶液4000 r/min离心20 min去 除沉淀，得到粉红色滤液。 六、注意事项 1.加入（NH4）2SO4时要先将其磨成粉末，再缓慢地 边搅拌边加入。 2. 10％NaOH溶液调混合液pH值至7.3时，一定不能 调过头，否则细胞色素C易变性。 3.透析时要求低温，透析袋要避免破漏，每隔几小时 要换透析液，并用Ba2+检查是否还有SO4 2－存在
七、思考题 1.为什么用0.145 mol/L TCA来抽提细胞色素C？ 2.加入硫酸铵时要注意什么？为什么？
七、思考题 1.为什么用0.145 mol/L TCA来抽提细胞色素C？ 2.加入硫酸铵时要注意什么？为什么？