糖实验技术模块教案 1. 教学目的要求： （1）掌握淀粉制备的方法，了解生物大分子制备方法。 （2）掌握糖的滴定分析方法，了解糖的其他分析方法。 （3）了解糖链的生物学意义和糖链制备方法。 2.教学时间：12 课时、 3.教学方式：讲授、实验 4.讲稿 实验一 淀粉的提取、水解和测定 利用直链淀粉和支链淀粉不溶于温水的原理，将地瓜捣碎后，静置于温水 中，淀粉沉积在烧杯的底部而与组织部分分离。 淀粉的水解有酸法水解和酶法水解，工业上的酸法水解是在 100℃以上的高 温条件下进行的，这样产生的葡萄糖会发生聚合反应，形成龙胆二糖、麦芽糖 等低聚糖，还会进一步分解形成羟甲基糠醛、乙酰丙酸等化合物，这样得到的 糖液色泽较深，味道变差。 糖的定量测定可以根据其物理性质或化学性质，通过测定糖液的折射率、比 重和旋光，可以测定出糖液中固形物的含量，工业上通常采用这类方法。通过 化学反应定量的方法有滴定法和比色法，Folin-酚试剂法和碱性铜试剂法属于滴 定法；3，5-二硝基水杨酸法和蒽酮反应法属于比色法。Folin-酚试剂法和碱性 铜试剂法的原理相同，都是利用二价铜被还原糖还原成一价铜，再测定一价铜 的含量而对还原糖的含量进行间接测定，但后者对前者作了改进，在滴定过程 中，反应液无须处于微沸状态。各种比色法是利用还原糖与试剂生成特殊的有 色物质，且还原糖的含量与有色物质的生成量有正比关系，先做出[S]∝A 的标 准曲线,测出待测还原糖的 A 后,从标准曲线上求出还原糖的含量. 实验二 酶的激活剂和抑制剂 酶的激活剂大部分是无机离子,包括钠离子、钾离子、钙离子等阳离子和氯 离子、溴离子、碘离子等阴离子;此外,小分子有机物,如抗坏血酸、谷胱甘肽等, 对含-SH 的酶有激活作用,EDTA、柠檬酸等能去除酶的抑制剂,也属于激活剂
糖实验技术模块教案 1. 教学目的要求： （1）掌握淀粉制备的方法，了解生物大分子制备方法。 （2）掌握糖的滴定分析方法，了解糖的其他分析方法。 （3）了解糖链的生物学意义和糖链制备方法。 2.教学时间：12 课时、 3.教学方式：讲授、实验 4.讲稿 实验一 淀粉的提取、水解和测定 利用直链淀粉和支链淀粉不溶于温水的原理，将地瓜捣碎后，静置于温水 中，淀粉沉积在烧杯的底部而与组织部分分离。 淀粉的水解有酸法水解和酶法水解，工业上的酸法水解是在 100℃以上的高 温条件下进行的，这样产生的葡萄糖会发生聚合反应，形成龙胆二糖、麦芽糖 等低聚糖，还会进一步分解形成羟甲基糠醛、乙酰丙酸等化合物，这样得到的 糖液色泽较深，味道变差。 糖的定量测定可以根据其物理性质或化学性质，通过测定糖液的折射率、比 重和旋光，可以测定出糖液中固形物的含量，工业上通常采用这类方法。通过 化学反应定量的方法有滴定法和比色法，Folin-酚试剂法和碱性铜试剂法属于滴 定法；3，5-二硝基水杨酸法和蒽酮反应法属于比色法。Folin-酚试剂法和碱性 铜试剂法的原理相同，都是利用二价铜被还原糖还原成一价铜，再测定一价铜 的含量而对还原糖的含量进行间接测定，但后者对前者作了改进，在滴定过程 中，反应液无须处于微沸状态。各种比色法是利用还原糖与试剂生成特殊的有 色物质，且还原糖的含量与有色物质的生成量有正比关系，先做出[S]∝A 的标 准曲线,测出待测还原糖的 A 后,从标准曲线上求出还原糖的含量. 实验二 酶的激活剂和抑制剂 酶的激活剂大部分是无机离子,包括钠离子、钾离子、钙离子等阳离子和氯 离子、溴离子、碘离子等阴离子;此外,小分子有机物,如抗坏血酸、谷胱甘肽等, 对含-SH 的酶有激活作用,EDTA、柠檬酸等能去除酶的抑制剂,也属于激活剂
《生化样品制备与分析》第一阶段总结 一、 成绩与问题: 我们利用四周的时间完成了 8 个实验,已完成了第一阶段的教学任务. 总体感觉不错,表现在: Δ、同学的学习态度认真,有相当部分同学预习较深,实验原则掌握透彻, 试验进展顺利,结果较好;部分同学试验出现失误,但能多次重做到获的良好 结果为止. Δ、同学们准时到课室,没有出现缺课,逃学现象. Δ、其他实验室规章制度遵守好,如损坏东西登记,卫生做得特别好. Δ、教师上课认真负责,各方法原理交代清楚,讲课有宽度、深度,便于学 生综合思维,示范指导认真. Δ、良好地完成从淀粉提取→酸解→总糖定量测顶的系统和以抽取的淀粉 为底物的淀粉酶专一性→抑制与激活剂→最佳 PH→最佳酶促反应温度→酶 反应动力学系统的学习. 表现还欠缺的问题： Δ、部分同学预习不够深入，对方法原理体会不深，对操作步骤中为什么 要这样做而不能那样做的问题理解不够，出现操作上的失误。如温度对酶活 性影响中，为什么要设计置冰箱理解不好。 Δ、操作上的失误还表现在一些常规的操作方法掌握不牢。如移液管的使 用、分光光度计使用上的不规范等；如同组的重复样品，OD 值有 0。287、0。 183 这样大的误差等。 Δ、实验报告中所反映出的实验数据理想化（被修改过），写作也不规范。 Δ、仪器数量少，试剂浪费严重等。 二、 与糖有关的实验的拓展 糖生物学被称为继核酸蛋白质之后的第二里程碑，其反馈的生物信息却 远远大于核酸和蛋白质，其重要性涉及到受体、供体、信号传导、免疫、 生物合成代谢等生物学重要问题，所以我们虽然学习了糖的一个系统性 实验，这个系统的取材是淀粉丰富的材料甘薯，是多糖，含葡萄糖，而 生物学中的许多内容与生物研究有关热点是糖蛋白，其种类繁多，组成 复杂，所以所学习的系统表现出简单化的局限性。因此同学们会问：糖 蛋白中的寡糖和糖链是怎样分离纯化的？其设计原理是什么？请看这张
《生化样品制备与分析》第一阶段总结 一、 成绩与问题: 我们利用四周的时间完成了 8 个实验,已完成了第一阶段的教学任务. 总体感觉不错,表现在: Δ、同学的学习态度认真,有相当部分同学预习较深,实验原则掌握透彻, 试验进展顺利,结果较好;部分同学试验出现失误,但能多次重做到获的良好 结果为止. Δ、同学们准时到课室,没有出现缺课,逃学现象. Δ、其他实验室规章制度遵守好,如损坏东西登记,卫生做得特别好. Δ、教师上课认真负责,各方法原理交代清楚,讲课有宽度、深度,便于学 生综合思维,示范指导认真. Δ、良好地完成从淀粉提取→酸解→总糖定量测顶的系统和以抽取的淀粉 为底物的淀粉酶专一性→抑制与激活剂→最佳 PH→最佳酶促反应温度→酶 反应动力学系统的学习. 表现还欠缺的问题： Δ、部分同学预习不够深入，对方法原理体会不深，对操作步骤中为什么 要这样做而不能那样做的问题理解不够，出现操作上的失误。如温度对酶活 性影响中，为什么要设计置冰箱理解不好。 Δ、操作上的失误还表现在一些常规的操作方法掌握不牢。如移液管的使 用、分光光度计使用上的不规范等；如同组的重复样品，OD 值有 0。287、0。 183 这样大的误差等。 Δ、实验报告中所反映出的实验数据理想化（被修改过），写作也不规范。 Δ、仪器数量少，试剂浪费严重等。 二、 与糖有关的实验的拓展 糖生物学被称为继核酸蛋白质之后的第二里程碑，其反馈的生物信息却 远远大于核酸和蛋白质，其重要性涉及到受体、供体、信号传导、免疫、 生物合成代谢等生物学重要问题，所以我们虽然学习了糖的一个系统性 实验，这个系统的取材是淀粉丰富的材料甘薯，是多糖，含葡萄糖，而 生物学中的许多内容与生物研究有关热点是糖蛋白，其种类繁多，组成 复杂，所以所学习的系统表现出简单化的局限性。因此同学们会问：糖 蛋白中的寡糖和糖链是怎样分离纯化的？其设计原理是什么？请看这张
分离纯化程序图： （一）糖蛋白中寡糖和糖链的分离纯化 —— 高等动、植物，微生物，地衣海藻等材料 醇、醚回流脱脂 （冷水，热水，碱性水，酸性水）水抽提（含有许多杂物质，如无机盐，低分子和大分子有机物） 分 离 离子交换、凝胶过滤、透析（去掉小分子） 蛋白酶，木质素酶等 酶解（去掉原有大分子蛋白） —— 氯仿或三氟三氯乙酸振荡（得水相，去蛋白） 分部沉淀法 盐析 金属络合法 纤维素柱层析 凝胶层析 离子交换层析 加 30%醇或酮 得沉淀物（大分子糖组分） 溶液相 纯 化 加 50%醇或酮 得沉淀物（中等分子组分糖） 溶液相 加更高浓度的醇或酮 得沉淀物（小分子组分糖） 废液 ——
分离纯化程序图： （一）糖蛋白中寡糖和糖链的分离纯化 —— 高等动、植物，微生物，地衣海藻等材料 醇、醚回流脱脂 （冷水，热水，碱性水，酸性水）水抽提（含有许多杂物质，如无机盐，低分子和大分子有机物） 分 离 离子交换、凝胶过滤、透析（去掉小分子） 蛋白酶，木质素酶等 酶解（去掉原有大分子蛋白） —— 氯仿或三氟三氯乙酸振荡（得水相，去蛋白） 分部沉淀法 盐析 金属络合法 纤维素柱层析 凝胶层析 离子交换层析 加 30%醇或酮 得沉淀物（大分子糖组分） 溶液相 纯 化 加 50%醇或酮 得沉淀物（中等分子组分糖） 溶液相 加更高浓度的醇或酮 得沉淀物（小分子组分糖） 废液 ——
其中部分介绍如下： ⚫ 盐析：不同糖在不同盐浓度中具有不同溶解度而逐步析出，如 NaCl，KCl，（NH4） 2SO4 等，后者最佳。 ⚫ 金属络合法：有些多糖能与铜、钙、钡等络合而沉淀，得到纯化物应该是盐类。 ⚫ 纤维素柱层析：多糖混合物用 4 倍体积乙醇全部沉淀于惰性多孔的纤维素柱上面， 然后用由高到低的不同浓度的乙醇洗脱，则不同多糖按小分子组分到大分子组分 的顺序被洗脱出来。 上述各种纯化方法可以灵活、交替使用，以求获得单组分的样品。 （二）有了纯化的单组分的糖，我们可以研究组分中单糖的组成，常用的方法有： Δ、纸层析 展层剂常用的是： 正丁醇：乙酸：水 为 4：1：5，用上层。 该展层剂可把葡萄糖，半乳糖，甘露糖，木糖，L-岩藻糖，葡萄糖醛酸，氨基葡 萄糖及氨基半乳糖依 迁移率的不同而分布在滤纸的不同的位置，而同时用已知单糖点样，层析为参比，即 可分析出某组分的糖 组成。（示范操作过程及结果分析，今后我们会做这方面实验。） Δ、薄层层析法（thin layer chromatography，TLC）。 常用的为硅胶 G（相当于滤纸）；展层剂可采用上。 Δ、气相层析（气相色谱） 流动相——惰性气体，如 CO2，N2 等。 固定相——担体颗粒表面所包裹的一种高沸点有机化合物。 塔板理论。 Δ、HPLC 在液、固相中分配时，与固定相亲和较弱的组分就快速通过层析柱而被记录或收 集，反之较后被记录。 前两法可用显色法检测。 Δ、苯胺-二苯胺显色剂：80℃、10min , 醛糖显蓝、蓝紫色或蓝绿色，酮糖呈棕色， 检出限量为 10ug. Δ、苯胺-邻苯二甲酸显色剂：105℃、5-10min,戊糖显鲜红色,巳醛糖及糖醛酸为棕 色,在紫外光下有荧光, 而一般戊糖则无荧光,可用来区别戊糖及巳糖,灵敏度为 1ug.氨基葡萄糖呈浅棕斑点, 紫外下呈黄绿色荧光
其中部分介绍如下： ⚫ 盐析：不同糖在不同盐浓度中具有不同溶解度而逐步析出，如 NaCl，KCl，（NH4） 2SO4 等，后者最佳。 ⚫ 金属络合法：有些多糖能与铜、钙、钡等络合而沉淀，得到纯化物应该是盐类。 ⚫ 纤维素柱层析：多糖混合物用 4 倍体积乙醇全部沉淀于惰性多孔的纤维素柱上面， 然后用由高到低的不同浓度的乙醇洗脱，则不同多糖按小分子组分到大分子组分 的顺序被洗脱出来。 上述各种纯化方法可以灵活、交替使用，以求获得单组分的样品。 （二）有了纯化的单组分的糖，我们可以研究组分中单糖的组成，常用的方法有： Δ、纸层析 展层剂常用的是： 正丁醇：乙酸：水 为 4：1：5，用上层。 该展层剂可把葡萄糖，半乳糖，甘露糖，木糖，L-岩藻糖，葡萄糖醛酸，氨基葡 萄糖及氨基半乳糖依 迁移率的不同而分布在滤纸的不同的位置，而同时用已知单糖点样，层析为参比，即 可分析出某组分的糖 组成。（示范操作过程及结果分析，今后我们会做这方面实验。） Δ、薄层层析法（thin layer chromatography，TLC）。 常用的为硅胶 G（相当于滤纸）；展层剂可采用上。 Δ、气相层析（气相色谱） 流动相——惰性气体，如 CO2，N2 等。 固定相——担体颗粒表面所包裹的一种高沸点有机化合物。 塔板理论。 Δ、HPLC 在液、固相中分配时，与固定相亲和较弱的组分就快速通过层析柱而被记录或收 集，反之较后被记录。 前两法可用显色法检测。 Δ、苯胺-二苯胺显色剂：80℃、10min , 醛糖显蓝、蓝紫色或蓝绿色，酮糖呈棕色， 检出限量为 10ug. Δ、苯胺-邻苯二甲酸显色剂：105℃、5-10min,戊糖显鲜红色,巳醛糖及糖醛酸为棕 色,在紫外光下有荧光, 而一般戊糖则无荧光,可用来区别戊糖及巳糖,灵敏度为 1ug.氨基葡萄糖呈浅棕斑点, 紫外下呈黄绿色荧光
后两法可用内标法定性(解释内标法)。 Δ、非还原糖可采用苯酚-硫酸法。 （三）、粗纤维的测定 在自然界中，还存在一类水不解，人畜无法消化、利用，稀酸、稀碱不溶的天然 有机物，无法按上述 程序所纯化，也无法按已做的实验方法所提纯，它们在食品、饲料工业中被作为一种 常规的组分进行分析， 它们被称为粗纤维。由于它们在工业上占有重要位置，所以在这里介绍粗纤维的提取 与测定。 Δ、原理： *、稀酸水解——去除样品中的淀粉，果胶质和部分纤维素。 *、氢氧化钠水解——去除蛋白质、部分半纤维素和部分木质素，并使脂肪皂化 而去除。 *、乙醇或乙醚洗涤——去除单宁、色素、残余脂肪、蜡、部分蛋白质和戊糖。 *、灰化——去除灰分（金属氧化物）。 Δ、课前准备（实验前准备）： *、清洗器皿。 *、取样，干燥。 *、H2SO4 和 NaOH 的标定：先用基准溶液 邻苯二甲酸氢钾标定 NaOH，配成 0。 313mol/l ，再用标准 NaOH 溶液标定 H2SO4，配成 0。1275mol/l 溶液（见 P123）。 *、酸，碱洗涤石棉（P15）。 *、石棉的铺层和坩埚的灼烧（见 P15），（600℃±15℃，2h，干燥，冷却，重 称 P0）。 Δ、粗纤维的提取与含量分析程序（见 P16）： 取材 研磨 烘干（105℃，4h，干燥器冷却） 称重（2。000g，m） 乙醇、乙醚脱脂 200ml，H2SO4，100℃水解半小时（冷凝管消泡） 布氏漏斗过滤（尼龙布抽滤） 沸水洗涤 呈中性（蒸馏水，下同） 移入烧杯（NaOH 洗净尼龙布） 移入三角瓶（补 NaOH 至 200ml） 100℃， 30min，水解（冷凝管） 坩埚（抽滤） 沸水洗（每次 50ml） 10%HCl 洗涤（去除酸可溶物质） 95%乙醇洗涤（10ml/次，2-3 次） 乙醚洗涤（5-10ml/次，数次） 烘干（105℃，4h ） 干 燥器冷却 称重（坩埚+纤维素+灰分，P1） 灼烧灰化（600℃，2h） 干燥器冷却 称重（坩埚+灰 分，P2）。 Δ、计算： P1-P2 P2-P0 烘干样品中粗纤维（%）= ×100， 烘干样品中灰分（%）= ×100， m m
后两法可用内标法定性(解释内标法)。 Δ、非还原糖可采用苯酚-硫酸法。 （三）、粗纤维的测定 在自然界中，还存在一类水不解，人畜无法消化、利用，稀酸、稀碱不溶的天然 有机物，无法按上述 程序所纯化，也无法按已做的实验方法所提纯，它们在食品、饲料工业中被作为一种 常规的组分进行分析， 它们被称为粗纤维。由于它们在工业上占有重要位置，所以在这里介绍粗纤维的提取 与测定。 Δ、原理： *、稀酸水解——去除样品中的淀粉，果胶质和部分纤维素。 *、氢氧化钠水解——去除蛋白质、部分半纤维素和部分木质素，并使脂肪皂化 而去除。 *、乙醇或乙醚洗涤——去除单宁、色素、残余脂肪、蜡、部分蛋白质和戊糖。 *、灰化——去除灰分（金属氧化物）。 Δ、课前准备（实验前准备）： *、清洗器皿。 *、取样，干燥。 *、H2SO4 和 NaOH 的标定：先用基准溶液 邻苯二甲酸氢钾标定 NaOH，配成 0。 313mol/l ，再用标准 NaOH 溶液标定 H2SO4，配成 0。1275mol/l 溶液（见 P123）。 *、酸，碱洗涤石棉（P15）。 *、石棉的铺层和坩埚的灼烧（见 P15），（600℃±15℃，2h，干燥，冷却，重 称 P0）。 Δ、粗纤维的提取与含量分析程序（见 P16）： 取材 研磨 烘干（105℃，4h，干燥器冷却） 称重（2。000g，m） 乙醇、乙醚脱脂 200ml，H2SO4，100℃水解半小时（冷凝管消泡） 布氏漏斗过滤（尼龙布抽滤） 沸水洗涤 呈中性（蒸馏水，下同） 移入烧杯（NaOH 洗净尼龙布） 移入三角瓶（补 NaOH 至 200ml） 100℃， 30min，水解（冷凝管） 坩埚（抽滤） 沸水洗（每次 50ml） 10%HCl 洗涤（去除酸可溶物质） 95%乙醇洗涤（10ml/次，2-3 次） 乙醚洗涤（5-10ml/次，数次） 烘干（105℃，4h ） 干 燥器冷却 称重（坩埚+纤维素+灰分，P1） 灼烧灰化（600℃，2h） 干燥器冷却 称重（坩埚+灰 分，P2）。 Δ、计算： P1-P2 P2-P0 烘干样品中粗纤维（%）= ×100， 烘干样品中灰分（%）= ×100， m m
Δ、组分分析：高温浓酸水解，分析。 三、有关酶学实验的拓展 我们完成了酶的特异性（专一性），激活与抑制，温度和 PH 对酶活性的影响和酶 反应动力学测定 5 个 实验。这五个实验前四个是定性的，后一个是定量的。这部分与前一部分实验的交叉 点是以淀粉为底物 构成的一系统。 Δ、定性与定量之间的异同： *、定性是研究的前期工作，是研究必不可少的环节。 *、定性分析的比较也是以定量的可比性来完成的。 *、定性实验有时会设计出极端的条件，如 0℃或 4℃了解温度对酶活力的影响。 *、实验设计的组数比较少。 *、结果比较直观可见。 Δ、定量分析的要求： *、应先完成定性分析，以助设计。 *、可通过文献资料掌握有关信息，以助设计。 *、设计组数至少 5 组以上。 *、操作要求更为严格。 *、以酶促反应速度，通过适宜的方法，比较单位时间，单位海量催化底物产生产 物的增加（量）或 底物的减少量来表示。 Δ、淀粉水解中颜色反应由蓝变蓝紫、变紫、变紫红、变红、最后变黄的过程，表示 淀粉被水解的程度， 由于各种颜色的溶液的最大吸光度波长不一样，可用分光光度计分析底物的减少，也 可用已学的还原糖定 量分析法分析葡萄糖的增加量。 Δ、拓展： ＊ 、可通过以后要学习的实验，开展酶的分离，纯化，理化特性分析研究。 ＊ 、纯化酶可进行结构、序列分析。 ＊ 、可通过修饰等方法掌握酶的活性中心。 ＊ 、可进行酶的细胞化学定位。 ＊ 、可进行同功酶分析，了解不同物种、品种、品系的遗传性差异
Δ、组分分析：高温浓酸水解，分析。 三、有关酶学实验的拓展 我们完成了酶的特异性（专一性），激活与抑制，温度和 PH 对酶活性的影响和酶 反应动力学测定 5 个 实验。这五个实验前四个是定性的，后一个是定量的。这部分与前一部分实验的交叉 点是以淀粉为底物 构成的一系统。 Δ、定性与定量之间的异同： *、定性是研究的前期工作，是研究必不可少的环节。 *、定性分析的比较也是以定量的可比性来完成的。 *、定性实验有时会设计出极端的条件，如 0℃或 4℃了解温度对酶活力的影响。 *、实验设计的组数比较少。 *、结果比较直观可见。 Δ、定量分析的要求： *、应先完成定性分析，以助设计。 *、可通过文献资料掌握有关信息，以助设计。 *、设计组数至少 5 组以上。 *、操作要求更为严格。 *、以酶促反应速度，通过适宜的方法，比较单位时间，单位海量催化底物产生产 物的增加（量）或 底物的减少量来表示。 Δ、淀粉水解中颜色反应由蓝变蓝紫、变紫、变紫红、变红、最后变黄的过程，表示 淀粉被水解的程度， 由于各种颜色的溶液的最大吸光度波长不一样，可用分光光度计分析底物的减少，也 可用已学的还原糖定 量分析法分析葡萄糖的增加量。 Δ、拓展： ＊ 、可通过以后要学习的实验，开展酶的分离，纯化，理化特性分析研究。 ＊ 、纯化酶可进行结构、序列分析。 ＊ 、可通过修饰等方法掌握酶的活性中心。 ＊ 、可进行酶的细胞化学定位。 ＊ 、可进行同功酶分析，了解不同物种、品种、品系的遗传性差异