厦门大学：《现代生物实验学》课程教学课件（实验PPT）实验九 质粒DNA的制备

实验九 碱变性法小量制备质粒 DNA

实验九 碱变性法小量制备质粒 DNA

一．实验目的及背景  质粒是染色体外的DNA分子，大小可为 1kb到200kb。  大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合 环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细 菌内的共生型遗传因子。  其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制 和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶

一．实验目的及背景  质粒是染色体外的DNA分子，大小可为 1kb到200kb。  大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合 环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细 菌内的共生型遗传因子。  其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制 和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶

质粒特点  质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞 一些表型，是比病毒更简单的原始生命。  质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到 雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子.  １９５２年由Lederburg正式命名为质粒

质粒特点  质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞 一些表型，是比病毒更简单的原始生命。  质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到 雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子.  １９５２年由Lederburg正式命名为质粒

质粒类型  质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒 和 严紧型质粒  1.松弛型质粒 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功 能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长 的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制 依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染 色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的 拷贝数可达2000-3000拷贝

质粒类型  质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒 和 严紧型质粒  1.松弛型质粒 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功 能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长 的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制 依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染 色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的 拷贝数可达2000-3000拷贝

2.严紧型质粒  严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白， 质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成 抑制剂来增加

2.严紧型质粒  严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白， 质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成 抑制剂来增加

质粒的应用  大多数基因工程使用松弛型质粒。  严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒 害致死的基因。  质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细 菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运 载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值

质粒的应用  大多数基因工程使用松弛型质粒。  严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒 害致死的基因。  质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细 菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运 载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值

本实验目的  本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法

本实验目的  本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法

分离质粒DNA方法  从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的  碱变性法；  煮沸法；  SDS法；  羟基磷灰石层析法等  各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、 碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法 既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切, 连接与转化

分离质粒DNA方法  从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的  碱变性法；  煮沸法；  SDS法；  羟基磷灰石层析法等  各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、 碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法 既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切, 连接与转化

碱变性法基本原理  在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌 染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状 态。  将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和 蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒 DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎 片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上 清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA

碱变性法基本原理  在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌 染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状 态。  将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和 蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒 DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎 片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上 清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA

实验试剂  ＬＢ培养基： 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 定容 1000ml pH 7.5 NaCl 10g  ＳＴＥ： 0.1M NaCl 10mM Tris HCl(pH8.0) 1mM EDTA  ＡｍＰ 50mg/ml  溶菌酶 10mg/ml (用10mM Tris·HCl pH8.0新鲜配制）

实验试剂  ＬＢ培养基： 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 定容 1000ml pH 7.5 NaCl 10g  ＳＴＥ： 0.1M NaCl 10mM Tris HCl(pH8.0) 1mM EDTA  ＡｍＰ 50mg/ml  溶菌酶 10mg/ml (用10mM Tris·HCl pH8.0新鲜配制）