实验十二 DNA的连接与转化 1.ＤＮＡ分子的体外连接 2．ＤＮＡ的转化及转化子的筛选
实验十二 DNA的连接与转化 1.ＤＮＡ分子的体外连接 2．ＤＮＡ的转化及转化子的筛选
一．实验目的及背景 ▪ 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当 的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定 重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段 之间的体外连接，从而获得重组子。 ▪ 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的 基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因 工程药物的生产），还可用于序列分析和转 基因等重要生物技术的研究中
一．实验目的及背景 ▪ 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当 的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定 重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段 之间的体外连接，从而获得重组子。 ▪ 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的 基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因 工程药物的生产），还可用于序列分析和转 基因等重要生物技术的研究中
1、ＤＮＡ分子的体外连接 ▪ ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组 邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸 酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接 是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进 行的
1、ＤＮＡ分子的体外连接 ▪ ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组 邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸 酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接 是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进 行的
连接反应中值得注意的几个问题： ▪ 1.ＤＮＡ连接酶 ▪ 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 ▪ 二者的作用机理类似
连接反应中值得注意的几个问题： ▪ 1.ＤＮＡ连接酶 ▪ 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 ▪ 二者的作用机理类似
Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制 ▪ Ｔ４连接酶作用分三步： ▪ １．Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形 成酶－ＡＭＰ复合物。 ▪ ２． 酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷 酸基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮ Ａ腺苷化。 ▪ ３．产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起 来
Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制 ▪ Ｔ４连接酶作用分三步： ▪ １．Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形 成酶－ＡＭＰ复合物。 ▪ ２． 酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷 酸基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮ Ａ腺苷化。 ▪ ３．产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起 来
2.连接反应的温度 ▪ ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃， ▪ 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳 定，折衷方法是１２℃过夜
2.连接反应的温度 ▪ ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃， ▪ 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳 定，折衷方法是１２℃过夜
3. DNA的平未端和粘性末端 ▪ 由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性 末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘 性末端连接。 二者连接效率不同。 ▪ 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度 选择上是有差异的
3. DNA的平未端和粘性末端 ▪ 由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性 末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘 性末端连接。 二者连接效率不同。 ▪ 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度 选择上是有差异的
4.碱性磷酸酶处理质粒载体 ▪ 为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的 浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮ Ａ自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体 用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸 基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可 在转化细胞后得以修复。见下图
4.碱性磷酸酶处理质粒载体 ▪ 为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的 浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮ Ａ自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体 用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸 基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可 在转化细胞后得以修复。见下图
5.连接反应的检测 ▪ 连接反应成功与否，最后的检测要通过下一 步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确 定。 ▪ 我们下面的实验从粘性末端为例操作
5.连接反应的检测 ▪ 连接反应成功与否，最后的检测要通过下一 步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确 定。 ▪ 我们下面的实验从粘性末端为例操作
▪ 二、实验试剂 ▪ １．纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 ▪ ２．１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer ▪ 200mM Tris-HCl(pH7.6) ▪ 50mM MgCl2 ▪ 50mM 二硫苄糖醇 ▪ 500μl/ml BSA ▪ ３．Ｔ４ＤＮＡ连接酶 ▪ ４．5mM ATP
▪ 二、实验试剂 ▪ １．纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 ▪ ２．１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer ▪ 200mM Tris-HCl(pH7.6) ▪ 50mM MgCl2 ▪ 50mM 二硫苄糖醇 ▪ 500μl/ml BSA ▪ ３．Ｔ４ＤＮＡ连接酶 ▪ ４．5mM ATP