厦门大学：《现代生物实验学》课程教学课件（PPT讲稿）实验十 DNA 片段从凝胶中回收

实验十 ＤＮＡ片段从琼脂糖凝胶 中的分离 DNA fragment recovery from the agrose gel

实验十 ＤＮＡ片段从琼脂糖凝胶 中的分离 DNA fragment recovery from the agrose gel

一．实验目的及背景  在生物技术实验中，ＰＣＲ反应获得的目的 片段，酶切后所得特定的ＤＮＡ序列， 分子 杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电 泳后，目的片段与其它ＤＮＡ分开， 这就需 要有一套方法将目的ＤＮＡ从凝胶中分离出 来，通过处理后得到纯化的目的ＤＮＡ， 以 用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析 等

一．实验目的及背景  在生物技术实验中，ＰＣＲ反应获得的目的 片段，酶切后所得特定的ＤＮＡ序列， 分子 杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电 泳后，目的片段与其它ＤＮＡ分开， 这就需 要有一套方法将目的ＤＮＡ从凝胶中分离出 来，通过处理后得到纯化的目的ＤＮＡ， 以 用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析 等

从凝胶中分离回收ＤＮＡ的方法 现在常用的技术有：  电洗脱法  低熔点琼脂糖凝胶法  ＤＥＡＥ滤膜插片法等  其中电洗脱法，经济节省，操作方便， 对Ｄ ＮＡ的回收效果好

从凝胶中分离回收ＤＮＡ的方法 现在常用的技术有：  电洗脱法  低熔点琼脂糖凝胶法  ＤＥＡＥ滤膜插片法等  其中电洗脱法，经济节省，操作方便， 对Ｄ ＮＡ的回收效果好

低熔点琼脂糖凝胶法  65oC琼脂糖凝胶熔点  低熔点琼脂糖凝胶 37oC 液体

低熔点琼脂糖凝胶法  65oC琼脂糖凝胶熔点  低熔点琼脂糖凝胶 37oC 液体

ＤＥＡＥ滤膜插片法  High efficient  DNA high quality for microinjection 

ＤＥＡＥ滤膜插片法  High efficient  DNA high quality for microinjection  <5kb fragment  100ng DNA fragment  10mmol/L EDTA(pH8.0) 5 minutes  0.5 mol/L NaOH 5 minutes  低盐缓冲液50mM/LTris .Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)  高盐缓冲液50mM/LTris .Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)

电洗脱法基本原理  将电泳分离后含目的ＤＮＡ片段的琼脂糖切 割下来， 装于透析袋中，继续在高电压下电 泳，这时目的ＤＮＡ会从凝胶中电泳出进入 透析袋中， 由于ＤＮＡ分子量大，不能透过 透析袋，从而保留于透析袋中。  取出透析袋中含ＤＮＡ的溶液， 进一步用酚、 氯仿抽提纯化

电洗脱法基本原理  将电泳分离后含目的ＤＮＡ片段的琼脂糖切 割下来， 装于透析袋中，继续在高电压下电 泳，这时目的ＤＮＡ会从凝胶中电泳出进入 透析袋中， 由于ＤＮＡ分子量大，不能透过 透析袋，从而保留于透析袋中。  取出透析袋中含ＤＮＡ的溶液， 进一步用酚、 氯仿抽提纯化

二．实验试剂及仪器  NaHCO3 2%  EDTA-Na2 0.01M  TBE电泳液 10.8g Tris碱 0.93g EDTA 5.5g 硼酸 调pH8.2 定容1000ml 琼脂糖 透析袋 ＴＥ 酚 氯仿 乙醇

二．实验试剂及仪器  NaHCO3 2%  EDTA-Na2 0.01M  TBE电泳液 10.8g Tris碱 0.93g EDTA 5.5g 硼酸 调pH8.2 定容1000ml 琼脂糖 透析袋 ＴＥ 酚 氯仿 乙醇

三、实验方法  一、透析袋的处理：  １．切取适当长度适析袋。  ２．在２％NaHCO3 1mM EDTA溶液中 煮沸１０分钟。  ３．弃去煮沸液，加无菌水内外反复洗净 透析袋

三、实验方法  一、透析袋的处理：  １．切取适当长度适析袋。  ２．在２％NaHCO3 1mM EDTA溶液中 煮沸１０分钟。  ３．弃去煮沸液，加无菌水内外反复洗净 透析袋

二、电洗脱  １．在长波紫外灯下（３００－３６０nm ）将含目标ＤＮ Ａ片段的凝胶条带切下装入透析袋中。  ２．向透析袋内加入２ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排 空汽泡。  ３．将透析袋水平放入电泳槽（长度方向与电泳平行）， 加 入适量缓冲液将透析袋浸没（约６－７mm）。  ４．接通电源，１５０伏电洗，在紫外灯下观察待ＤＮＡ全 部移出凝胶。  ５．改变电场方向继续通电１分钟。  ６．从透析袋中吸出缓冲液于１－５ml Eppendorf管中

二、电洗脱  １．在长波紫外灯下（３００－３６０nm ）将含目标ＤＮ Ａ片段的凝胶条带切下装入透析袋中。  ２．向透析袋内加入２ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排 空汽泡。  ３．将透析袋水平放入电泳槽（长度方向与电泳平行）， 加 入适量缓冲液将透析袋浸没（约６－７mm）。  ４．接通电源，１５０伏电洗，在紫外灯下观察待ＤＮＡ全 部移出凝胶。  ５．改变电场方向继续通电１分钟。  ６．从透析袋中吸出缓冲液于１－５ml Eppendorf管中

 ７．加入１．５倍体积正丁醇，混匀抽提去Ｅ Ｂ。  ８．在台式离心机上最高速２分钟。  ９．吸去上层，正丁醇溶液。  １０．重复７，８，９二次。  １１．自下层言ＤＮＡ的溶液中加入等体积酚 氯仿（２个）抽提２次。  １２．上清转入另一Eppendorf管中加入1/10 倍体积3M NaAc ２倍体积预冷无水乙醇，于 ２０℃过夜

 ７．加入１．５倍体积正丁醇，混匀抽提去Ｅ Ｂ。  ８．在台式离心机上最高速２分钟。  ９．吸去上层，正丁醇溶液。  １０．重复７，８，９二次。  １１．自下层言ＤＮＡ的溶液中加入等体积酚 氯仿（２个）抽提２次。  １２．上清转入另一Eppendorf管中加入1/10 倍体积3M NaAc ２倍体积预冷无水乙醇，于 ２０℃过夜