实验十 ＤＮＡ片段从琼脂糖凝胶 中的分离 DNA fragment recovery from the agrose gel
实验十 ＤＮＡ片段从琼脂糖凝胶 中的分离 DNA fragment recovery from the agrose gel
一．实验目的及背景 在生物技术实验中，ＰＣＲ反应获得的目的 片段，酶切后所得特定的ＤＮＡ序列， 分子 杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电 泳后，目的片段与其它ＤＮＡ分开， 这就需 要有一套方法将目的ＤＮＡ从凝胶中分离出 来，通过处理后得到纯化的目的ＤＮＡ， 以 用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析 等
一．实验目的及背景 在生物技术实验中，ＰＣＲ反应获得的目的 片段，酶切后所得特定的ＤＮＡ序列， 分子 杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电 泳后，目的片段与其它ＤＮＡ分开， 这就需 要有一套方法将目的ＤＮＡ从凝胶中分离出 来，通过处理后得到纯化的目的ＤＮＡ， 以 用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析 等
从凝胶中分离回收ＤＮＡ的方法 现在常用的技术有： 电洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶法 ＤＥＡＥ滤膜插片法等 其中电洗脱法，经济节省，操作方便， 对Ｄ ＮＡ的回收效果好
从凝胶中分离回收ＤＮＡ的方法 现在常用的技术有： 电洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶法 ＤＥＡＥ滤膜插片法等 其中电洗脱法，经济节省，操作方便， 对Ｄ ＮＡ的回收效果好
低熔点琼脂糖凝胶法 65oC琼脂糖凝胶熔点 低熔点琼脂糖凝胶 37oC 液体
低熔点琼脂糖凝胶法 65oC琼脂糖凝胶熔点 低熔点琼脂糖凝胶 37oC 液体
ＤＥＡＥ滤膜插片法 High efficient DNA high quality for microinjection <5kb fragment 100ng DNA fragment 10mmol/L EDTA(pH8.0) 5 minutes 0.5 mol/L NaOH 5 minutes 低盐缓冲液50mM/LTris .Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0) 高盐缓冲液50mM/LTris .Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)
ＤＥＡＥ滤膜插片法 High efficient DNA high quality for microinjection <5kb fragment 100ng DNA fragment 10mmol/L EDTA(pH8.0) 5 minutes 0.5 mol/L NaOH 5 minutes 低盐缓冲液50mM/LTris .Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0) 高盐缓冲液50mM/LTris .Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)
电洗脱法基本原理 将电泳分离后含目的ＤＮＡ片段的琼脂糖切 割下来， 装于透析袋中，继续在高电压下电 泳，这时目的ＤＮＡ会从凝胶中电泳出进入 透析袋中， 由于ＤＮＡ分子量大，不能透过 透析袋，从而保留于透析袋中。 取出透析袋中含ＤＮＡ的溶液， 进一步用酚、 氯仿抽提纯化
电洗脱法基本原理 将电泳分离后含目的ＤＮＡ片段的琼脂糖切 割下来， 装于透析袋中，继续在高电压下电 泳，这时目的ＤＮＡ会从凝胶中电泳出进入 透析袋中， 由于ＤＮＡ分子量大，不能透过 透析袋，从而保留于透析袋中。 取出透析袋中含ＤＮＡ的溶液， 进一步用酚、 氯仿抽提纯化
二．实验试剂及仪器 NaHCO3 2% EDTA-Na2 0.01M TBE电泳液 10.8g Tris碱 0.93g EDTA 5.5g 硼酸 调pH8.2 定容1000ml 琼脂糖 透析袋 ＴＥ 酚 氯仿 乙醇
二．实验试剂及仪器 NaHCO3 2% EDTA-Na2 0.01M TBE电泳液 10.8g Tris碱 0.93g EDTA 5.5g 硼酸 调pH8.2 定容1000ml 琼脂糖 透析袋 ＴＥ 酚 氯仿 乙醇
三、实验方法 一、透析袋的处理： １．切取适当长度适析袋。 ２．在２％NaHCO3 1mM EDTA溶液中 煮沸１０分钟。 ３．弃去煮沸液，加无菌水内外反复洗净 透析袋
三、实验方法 一、透析袋的处理： １．切取适当长度适析袋。 ２．在２％NaHCO3 1mM EDTA溶液中 煮沸１０分钟。 ３．弃去煮沸液，加无菌水内外反复洗净 透析袋
二、电洗脱 １．在长波紫外灯下（３００－３６０nm ）将含目标ＤＮ Ａ片段的凝胶条带切下装入透析袋中。 ２．向透析袋内加入２ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排 空汽泡。 ３．将透析袋水平放入电泳槽（长度方向与电泳平行）， 加 入适量缓冲液将透析袋浸没（约６－７mm）。 ４．接通电源，１５０伏电洗，在紫外灯下观察待ＤＮＡ全 部移出凝胶。 ５．改变电场方向继续通电１分钟。 ６．从透析袋中吸出缓冲液于１－５ml Eppendorf管中
二、电洗脱 １．在长波紫外灯下（３００－３６０nm ）将含目标ＤＮ Ａ片段的凝胶条带切下装入透析袋中。 ２．向透析袋内加入２ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排 空汽泡。 ３．将透析袋水平放入电泳槽（长度方向与电泳平行）， 加 入适量缓冲液将透析袋浸没（约６－７mm）。 ４．接通电源，１５０伏电洗，在紫外灯下观察待ＤＮＡ全 部移出凝胶。 ５．改变电场方向继续通电１分钟。 ６．从透析袋中吸出缓冲液于１－５ml Eppendorf管中
７．加入１．５倍体积正丁醇，混匀抽提去Ｅ Ｂ。 ８．在台式离心机上最高速２分钟。 ９．吸去上层，正丁醇溶液。 １０．重复７，８，９二次。 １１．自下层言ＤＮＡ的溶液中加入等体积酚 氯仿（２个）抽提２次。 １２．上清转入另一Eppendorf管中加入1/10 倍体积3M NaAc ２倍体积预冷无水乙醇，于 ２０℃过夜
７．加入１．５倍体积正丁醇，混匀抽提去Ｅ Ｂ。 ８．在台式离心机上最高速２分钟。 ９．吸去上层，正丁醇溶液。 １０．重复７，８，９二次。 １１．自下层言ＤＮＡ的溶液中加入等体积酚 氯仿（２个）抽提２次。 １２．上清转入另一Eppendorf管中加入1/10 倍体积3M NaAc ２倍体积预冷无水乙醇，于 ２０℃过夜