细胞工程实验实验指导书
1 细胞工程实验 实验指导书
目录实验一细胞工程实验基本操作技术·3实验二植物组织及愈伤组织诱导技术5实验三器官发生与植株再生调控培养实验四茎尖脱毒培养·8附表MS培养基配方·102
2 目 录 实验一 细胞工程实验基本操作技术.3 实验二 植物组织及愈伤组织诱导技术.5 实验三 器官发生与植株再生调控培养.7 实验四 茎尖脱毒培养.8 附 表 MS培养基配方.10
实验1细胞工程实验基本操作技术实验准备：MS培养基母液配制：按配方表配制MS培养基母液：大量元素配10X，微量元素和其它成分配制成100×，母液贮存于2～4℃的冰箱中。一、实验目的1、使学生了解培养基母液的配制方法和注意事项2、掌握培养基的配制及灭菌方法，为植物愈伤组织诱导实验准备培养基。二、实验原理将配制好的母液按照培养基配方所需量分别量取，使培养基中含有植物细胞生长所必需的各类营养物质。培养基除了向植物提供养分外，还是微生物繁殖的极好场所，因此，在使用前必须对培养基进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法，即将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，加热提高温度，使锅内的蒸汽不能溢出，从而使压力增加，沸点升高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。三、实验器具与试剂50ml量筒、1000ml有刻度烧杯、吸球、电炉、5ml移液管，500ml三角瓶10个、培养皿25个、pH计、高压灭菌锅、蒸馏水。四、操作方法实验按500ml容量一组配制培养基，每组各配制两瓶250mlMS培养基。1、母液配制一般大量元素配制成20倍母液，微量元素和其它成分配制成200倍母液。常用的MS培养基母液配制见附表1。配好的母液需贮存于2～4℃的冰箱中，定期检查有无沉淀和微生物污染，2、向容量瓶中顺序加入培养基母液：大量元素25ml；微量元素2.5ml；铁盐2.5ml；其它成分各2.5ml；3、加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水，加入15g蔗糖后搅拌使其溶化，用0.5N的NaOH和0.5N的HCI调整pH至5.8-6.0。4、加入3.5g琼脂，将烧杯置于电炉上，搅拌加热使琼脂完全溶化，然后用蒸馅水定容至终体积500ml，继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中。用记号笔标记。3
3 实验 1 细胞工程实验基本操作技术 实验准备： MS 培养基母液配制：按配方表配制 MS 培养基母液：大量元素配 10×，微量元素和其它成分配制 成 100×，母液贮存于 2～4℃的冰箱中。 一、实验目的 1、使学生了解培养基母液的配制方法和注意事项； 2、掌握培养基的配制及灭菌方法，为植物愈伤组织诱导实验准备培养基。 二、实验原理 将配制好的母液按照培养基配方所需量分别量取，使培养基中含有植物细胞生长所必需的各类营养 物质。培养基除了向植物提供养分外，还是微生物繁殖的极好场所，因此，在使用前必须对培养基进行 灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法，即将待灭菌的物品放在一 个密闭的加压灭菌锅内，加热提高温度，使锅内的蒸汽不能溢出，从而使压力增加，沸点升高，得到高 于 100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 三、实验器具与试剂 50ml 量筒、1000ml 有刻度烧杯、吸球、电炉、5ml 移液管，500ml 三角瓶 10 个、培养皿 25 个、 pH 计、高压灭菌锅、蒸馏水。 四、操作方法 实验按 500ml 容量一组配制培养基，每组各配制两瓶 250ml MS 培养基。 1、母液配制 一般大量元素配制成 20 倍母液，微量元素和其它成分配制成 200 倍母液。常用的 MS 培养基母液 配制见附表 1。配好的母液需贮存于 2～4℃的冰箱中，定期检查有无沉淀和微生物污染。 2、向容量瓶中顺序加入培养基母液： 大量元素 25ml；微量元素 2.5ml；铁 盐 2.5ml；其它成分各 2.5ml； 3、加入实际配制培养基体积约 2/3-3/4 的蒸馏水，加入 15g 蔗糖后搅拌使其溶化，用 0.5N 的 NaOH 和 0.5N 的 HCl 调整 pH 至 5.8-6.0。 4、加入 3.5g 琼脂，将烧杯置于电炉上，搅拌加热使琼脂完全溶化，然后用蒸馏水定容至终体积 500ml，继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中。用记号笔标记
5、培养基及实验用具灭菌：分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121℃，压力1.1kg/cm2，灭菌时间20min左右。灭菌完成后，待高压灭菌锅的压力表指示为0，温度降到94℃以下时，方可打开灭菌锅，取出灭菌物品。灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。室温下最好在1～2周内用完，特殊情况可贮存于4℃下1个月左右。玻璃器皿可任选湿热和干热灭菌方法灭菌。湿热灭菌条件与培养基灭菌条件一致，但要适当延长灭菌时间，一般以25～30分钟为宜。器皿灭菌后应及时放入净化工作台上吹干。干热灭菌即在烘箱中加热至160～180℃后恒温保持40分钟，或120℃灭菌2小时。玻璃器皿放入烘箱之前必须完全干燥，灭菌后待温度逐渐下降到60℃以下时才能开箱门，以免器血因突然冷缩而破碎。五、记载内容1、MS培养基成分（作表)。2、母液配制方法及注意事项。4
4 5、培养基及实验用具灭菌： 分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度 121℃，压力 1.1kg/cm2，灭菌时间 20min 左右。灭菌完成后，待高压灭菌锅的压力表指示为 0，温度降到 94℃以下时，方可打开灭菌锅， 取出灭菌物品。灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。室温下最好在 1～2 周内用完，特殊情况可贮存 于 4℃下 1 个月左右。 玻璃器皿可任选湿热和干热灭菌方法灭菌。湿热灭菌条件与培养基灭菌条件一致，但要适当延长灭 菌时间，一般以 25～30 分钟为宜。器皿灭菌后应及时放入净化工作台上吹干。干热灭菌即在烘箱中加 热至 160～180℃后恒温保持 40 分钟，或 120℃灭菌 2 小时。玻璃器皿放入烘箱之前必须完全干燥，灭 菌后待温度逐渐下降到 60℃以下时才能开箱门，以免器皿因突然冷缩而破碎。 五、记载内容 1、MS 培养基成分（作表）。 2、母液配制方法及注意事项
实验2植物组织及愈伤组织诱导技术实验准备：植物激素配制：BA和NAA配制成浓度为1mg/ml的溶液，贮存在2～4℃下备用。实验课开始前30min，将实验用具、胡萝下及超净工作台同时用75%酒精擦洗，打开超净工作台风机和紫外灯。一、实验目的1、掌握外植体接种的无菌操作技术；2、基本掌握植物愈伤组织诱导培养技术和调控条件。二、实验原理消毒的目标是既要消灭材料上的细菌，又不损伤植物材料。因此，消毒一方面要考虑杀菌剂对各类菌的效果，还要考虑植物材料对杀菌剂的忍耐力。从中选出最有效的杀菌剂。愈伤组织诱导是根据植物细胞的全能性，即分化细胞保留有植物全部的基因组，具有生长发育的全部遗传信息，具有在在适宜条件下发育成完整个体的潜能。外植体在合适的培养基上，通过脱分化，首先形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团。细胞团在培养过程中，其外层细胞开始迅速分裂，使细胞脱分化。脱分化细胞不断进行分裂，从而形成愈伤组织。植物生长调节剂在外植体形成愈伤组织和愈伤组织分化的过程中起到重要作用。三、实验器具与试剂超净工作台；不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯、无菌水、75%酒精、实验1配制的培养基。四、实验材料新鲜胡萝卜或紫苏子叶五、操作方法1、植物激素配制植物激素一般配制成浓度为1.0mg/ml的溶液，贮存在2～4℃下备用。一般按以下方法配制。NAA：可溶于热水中，也可采用少量95%乙醇使之充分溶解，再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。细胞分裂素类：KT和BA等细胞分裂素类物质均溶于稀盐酸，应先用少量1N的HCI溶解后再稀释至需要浓度。5
5 实验 2 植物组织及愈伤组织诱导技术 实验准备： 植物激素配制：BA 和 NAA 配制成浓度为 1mg/ml 的溶液，贮存在 2～4℃下备用。 实验课开始前 30min，将实验用具、胡萝卜及超净工作台同时用 75%酒精擦洗，打开超净工作台风 机和紫外灯。 一、实验目的 1、掌握外植体接种的无菌操作技术； 2、基本掌握植物愈伤组织诱导培养技术和调控条件。 二、实验原理 消毒的目标是既要消灭材料上的细菌，又不损伤植物材料。因此，消毒一方面要考虑杀菌剂对各类 菌的效果，还要考虑植物材料对杀菌剂的忍耐力。从中选出最有效的杀菌剂。 愈伤组织诱导是根据植物细胞的全能性，即分化细胞保留有植物全部的基因组，具有生长发育的全 部遗传信息，具有在在适宜条件下发育成完整个体的潜能。外植体在合适的培养基上，通过脱分化，首 先形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团。细胞团在培养过程中，其外层细胞开始迅速分裂， 使细胞脱分化。脱分化细胞不断进行分裂，从而形成愈伤组织。植物生长调节剂在外植体形成愈伤组织 和愈伤组织分化的过程中起到重要作用。 三、实验器具与试剂 超净工作台；不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯、无菌水、75%酒精、实验 1 配制的培养基。 四、实验材料 新鲜胡萝卜或紫苏子叶 五、操作方法 1、植物激素配制 植物激素一般配制成浓度为 1.0mg/ml 的溶液，贮存在 2～4℃下备用。一般按以下方法配制。 NAA： 可溶于热水中，也可采用少量 95%乙醇使之充分溶解，再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。 细胞分裂素类： KT 和 BA 等细胞分裂素类物质均溶于稀盐酸，应先用少量 1N 的 HCl 溶解后再稀 释至需要浓度
2、在自来水管下将手洗净，然后用75%酒精将手消毒，再进入超净工作台开始配制诱导愈伤组织培养基和接种操作。3、用移液器向实验1中配制的250mlMS培养基中加入0.5mlBA和0.075mlNAA，配制成MS+BA2mg/1+NAA0.3mg/1+Sucrose20g/1+Agar7g/1的诱导愈伤培养基，混匀后，分装与五个培养皿中，等培养基凝固后备用。4、点燃酒精灯，将浸泡于70%酒精中的镊子、解剖刀在酒精灯下灭菌烤干。5、外植体灭菌：a.选取生长正常、无病虫危害的组织材料，除去多余部分后将材料整理成适当的大小放入烧杯中。特别不洁的材料则应先行用自来水冲洗。b.用70~75%的乙醇处理材料0.5~1min.，立即除去乙醇。c.然后在烧杯中加入消毒剂（建议使用次氯酸钠或饱和漂白粉溶液），同时滴1~2滴土温20。将烧杯置于摇床上振荡10～15min。如果材料污染较严重或组织较老，可适当考虑延长灭菌时间d.将烧杯置于净化工作台上，弃去消毒液，用无菌水清洗3～4次，每次1min。e.灭菌后的材料可置于垫有无菌纸的培养皿中备用。6、接种（胡萝卜愈伤组织培养）：将灭菌后的胡萝卜块用无菌吸水纸吸干水分置于无菌培养皿中并用锋利解剖刀切成2mm左右的小片，然后将其接种于准备好的诱导培养基上，一般每瓶接种4-5小片。7、快速封好瓶口，用记号笔标记。置于24℃条件下培养直至愈伤组织形成。六、记载内容1、植物激素BA和NAA的配制方法及其在培养基中的主要作用是什么？2、实验用具以及外植体的灭菌方法有什么不同？6
6 2、在自来水管下将手洗净，然后用 75%酒精将手消毒，再进入超净工作台开始配制诱导愈伤组织 培养基和接种操作。 3、用移液器向实验 1 中配制的 250ml MS 培养基中加入 0.5ml BA 和 0.075ml NAA，配制成 MS＋ BA 2mg/1+NAA 0.3mg/1+ Sucrose 20g/1+ Agar 7g/1 的诱导愈伤培养基，混匀后，分装与五个培养皿中， 等培养基凝固后备用。 4、点燃酒精灯，将浸泡于 70%酒精中的镊子、解剖刀在酒精灯下灭菌烤干。 5、外植体灭菌： a. 选取生长正常、无病虫危害的组织材料，除去多余部分后将材料整理成适当的大小放入烧杯中。 特别不洁的材料则应先行用自来水冲洗。 b. 用 70～75％的乙醇处理材料 0.5～1 min.，立即除去乙醇。 c. 然后在烧杯中加入消毒剂（建议使用次氯酸钠或饱和漂白粉溶液），同时滴 1～2 滴土温 20。将 烧杯置于摇床上振荡 10～15min。如果材料污染较严重或组织较老，可适当考虑延长灭菌时间。 d. 将烧杯置于净化工作台上，弃去消毒液，用无菌水清洗 3～4 次，每次 1min。 e. 灭菌后的材料可置于垫有无菌纸的培养皿中备用。 6、接种（胡萝卜愈伤组织培养）：将灭菌后的胡萝卜块用无菌吸水纸吸干水分置于无菌培养皿中， 并用锋利解剖刀切成 2mm2 左右的小片，然后将其接种于准备好的诱导培养基上，一般每瓶接种 4-5 小 片。 7、快速封好瓶口，用记号笔标记。置于 24℃条件下培养直至愈伤组织形成。 六、记载内容 1、植物激素 BA 和 NAA 的配制方法及其在培养基中的主要作用是什么？ 2、实验用具以及外植体的灭菌方法有什么不同？
实验3器官发生与植株再生调控培养实验准备：配制器官分化培养基。实验课开始前30min，将实验用具、超净工作台用75%酒精擦洗，打开超净工作台风机和紫外灯。一、实验目的1、了解器官分化和植株再生的过程；2、掌握离体培养中的转接技术。二、实验原理植物离体器官发生是指在培养条件下离体的组织或细胞分化形成不定芽、根或花芽等器官的过程。早期对生长调节剂响应的基因及调节器官决定基因的上游基因能否启动表达是离体器官发生的关键。在含有诱导细胞分化的生长调节剂培养基上，愈伤组织可在短时间内分化出器官，再分化出大量试管苗，经过继代培养、生根培养，可获得完整的再生植株。三、实验器具与试剂超净工作台：不锈钢镊子、剪刀、酒精灯、无菌水、次氯酸钠、75%酒精、实验1配制的培养基。四、实验材料紫苏子叶或下胚轴愈伤组织五、操作方法1、在自来水管下将手洗净，然后用75%酒精将手消毒，再进入超净工作台开始离体转接操作。2、用移液器向实验1中配制的250mlMS培养基中加入0.75mlBA和0.0375mlNAA，配制成MS+BA3mg/1+NAA0.15mg/1+Sucrose20g/1+Agar7g/1的诱导愈伤分化培养基，混匀后，分装与五个培养血中，等培养基凝固后备用。3、点燃酒精灯，将浸泡于酒精中的镊子、解剖刀在酒精灯下灭菌烤干。4、用镊子取出一块愈伤组织放在无菌培养血内，用解剖刀将其切成5mm2左右大小，迅速将其接种于准备好的分化培养基上，每瓶接种4-5块。5、快速封好瓶口，用记号笔标记。置于20土1℃、16h/d光照条件下培养，培养3-4周后，在愈伤组织上长出分化芽。7
7 实验 3 器官发生与植株再生调控培养 实验准备： 配制器官分化培养基。 实验课开始前 30min，将实验用具、超净工作台用 75%酒精擦洗，打开超净工作台风机和紫外灯。 一、实验目的 1、了解器官分化和植株再生的过程； 2、掌握离体培养中的转接技术。 二、实验原理 植物离体器官发生是指在培养条件下离体的组织或细胞分化形成不定芽、根或花芽等器官的过程。 早期对生长调节剂响应的基因及调节器官决定基因的上游基因能否启动表达是离体器官发生的关键。在 含有诱导细胞分化的生长调节剂培养基上，愈伤组织可在短时间内分化出器官，再分化出大量试管苗， 经过继代培养、生根培养，可获得完整的再生植株。 三、实验器具与试剂 超净工作台；不锈钢镊子、剪刀、酒精灯、无菌水、次氯酸钠、75%酒精、实验 1 配制的培养基。 四、实验材料 紫苏子叶或下胚轴愈伤组织 五、操作方法 1、在自来水管下将手洗净，然后用 75%酒精将手消毒，再进入超净工作台开始离体转接操作。 2、用移液器向实验 1 中配制的 250ml MS 培养基中加入 0.75ml BA 和 0.0375ml NAA，配制成 MS ＋BA 3mg/1+NAA 0.15mg/1+ Sucrose 20g/1+ Agar 7g/1 的诱导愈伤分化培养基，混匀后，分装与五个培 养皿中，等培养基凝固后备用。 3、点燃酒精灯，将浸泡于酒精中的镊子、解剖刀在酒精灯下灭菌烤干。 4、用镊子取出一块愈伤组织放在无菌培养皿内，用解剖刀将其切成 5mm3 左右大小，迅速将其接 种于准备好的分化培养基上，每瓶接种 4-5 块。 5、快速封好瓶口，用记号笔标记。置于 20±1℃、16h/d 光照条件下培养，培养 3-4 周后，在愈伤 组织上长出分化芽
六、记载内容1、接种外植体大小、接种瓶数、每瓶接种量等实验操作过程。2、影响器官分化的因素有哪些？实验4茎尖脱毒培养实验准备：配制MS繁殖培养基。实验课开始前30min，将实验用具、超净工作台用75%酒精擦洗，打开超净工作台风机和紫外灯。一、实验目的1、了解芽的诱导和灭菌技术；2、掌握茎尖脱毒技术。二、实验原理植物茎尖脱毒机理尚不是很明确，普遍认为植物体内病毒通过维管束传播，而植物茎尖维管束不发达，植物病毒不能到达茎尖部位，从而通过茎尖培养达到脱毒的目的。三、实验器具与试剂超净工作台：不锈钢镊子、剪刀、酒精灯、解剖镜、无菌水、次氯酸钠、75%酒精、实验1配制的培养基。四、实验材料大蒜五、操作方法1、材料预处理a.选取生长正常，无病虫害危害的大蒜，在自来水下冲洗干净，漓干；b.取一只磁盘，将几层纱布浸湿垫在盘底，将大蒜摆在其中，再覆盖浸湿的纱布，然后置于25-27℃黑暗下；c.待芽眼萌动，顶芽大约5mm长时，除去覆盖的纱布，将其移入光照生长箱中，其中光照强度为8
8 六、记载内容 1、接种外植体大小、接种瓶数、每瓶接种量等实验操作过程。 2、影响器官分化的因素有哪些？ 实验 4 茎尖脱毒培养 实验准备： 配制 MS 繁殖培养基。 实验课开始前 30min，将实验用具、超净工作台用 75%酒精擦洗，打开超净工作台风机和紫外灯。 一、实验目的 1、了解芽的诱导和灭菌技术； 2、掌握茎尖脱毒技术。 二、实验原理 植物茎尖脱毒机理尚不是很明确，普遍认为植物体内病毒通过维管束传播，而植物茎尖维管束不发 达，植物病毒不能到达茎尖部位，从而通过茎尖培养达到脱毒的目的。 三、实验器具与试剂 超净工作台；不锈钢镊子、剪刀、酒精灯、解剖镜、无菌水、次氯酸钠、75%酒精、实验 1 配制的 培养基。 四、实验材料 大蒜 五、操作方法 1、材料预处理 a. 选取生长正常，无病虫害危害的大蒜，在自来水下冲洗干净，漓干； b. 取一只磁盘，将几层纱布浸湿垫在盘底，将大蒜摆在其中，再覆盖浸湿的纱布，然后置于 25-27℃ 黑暗下； c. 待芽眼萌动，顶芽大约 5mm 长时，除去覆盖的纱布，将其移入光照生长箱中，其中光照强度为
3000~4000x，光照时间每天16h，气温白天约为36℃，夜间约为33℃；2、茎尖剥离与培养a经过6周的热处理之后，切取适当长度的芽，按照外植体灭菌方法灭菌。b.将双筒解剖镜置于超净工作台上，用75%乙醇将载物台擦洗干净，并用紫外灯照射20min；.取一无菌培养血，将灭菌后的芽置于培养皿中，然后置于解剖镜载物台上，左手用镊子固定和调整芽的位置，右手持解剖刀，在解剖镜下将茎尖解剖只剩下2个最幼小的叶原基时，切下茎尖（300-600um长），接种在MS繁殖培养基上，在24℃，每天16h光照的条件下培养；d.当茎长到3cm甚至更长并已生根时，即可切段繁殖，每一个茎尖的植株单独编号繁殖：e.取每一茎尖的部分植株进行病毒检测，经检测后无病毒株保留继续扩繁，其它没有彻底脱毒的植株销毁。六、记载内容1、对植株进行病毒检测的方法有哪些？2、植物茎尖脱毒的实际意义是什么？9
9 3000~4000 lx，光照时间每天 16h，气温白天约为 36℃，夜间约为 33℃； 2、茎尖剥离与培养 a. 经过 6 周的热处理之后，切取适当长度的芽，按照外植体灭菌方法灭菌。 b. 将双筒解剖镜置于超净工作台上，用 75%乙醇将载物台擦洗干净，并用紫外灯照射 20min； c. 取一无菌培养皿，将灭菌后的芽置于培养皿中，然后置于解剖镜载物台上，左手用镊子固定和 调整芽的位置，右手持解剖刀，在解剖镜下将茎尖解剖只剩下 2 个最幼小的叶原基时，切下茎尖（300-600 μm 长），接种在 MS 繁殖培养基上，在 24℃，每天 16h 光照的条件下培养； d. 当茎长到 3cm 甚至更长并已生根时，即可切段繁殖，每一个茎尖的植株单独编号繁殖； e. 取每一茎尖的部分植株进行病毒检测，经检测后无病毒株保留继续扩繁，其它没有彻底脱毒的 植株销毁。 六、记载内容 1、对植株进行病毒检测的方法有哪些？ 2、植物茎尖脱毒的实际意义是什么？
附表MS培养基母液配制成分1L母液用量（mg/1)每升培养基取用量（ml）大量元素（200×）33000NHNOKNO,38000CaCl2-2Ha0508800MgSO,-7H.074003400KH,PO,铁盐*（200×）55605FeSO+-7H0Na2-EDTA-7HaD7460微量元素（200×）KI1661240H,BO,5MnSO+-4H:04460ZnSO,-7Ha0172050NaMoO+-2Ha0CuSO,-5H:055CoCl-6H0维生素（200×）烟酸100205VBiVB,100肌醇（200×）肌醇520000甘氨酸（200×）甘氨酸4005*铁盐的配制方法：分别溶解FeSO·7HaO和Na·EDTA·7HO在适当体积的蒸馏水中，适当加热并不停搅拌，待完全溶解后将二者混合在一起，调整pH至5.5，最后定容至1000ml。10
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