基因工程实验指导书
基 因 工 程 实验指导书
目录实验一CTAB法分离植物组织总核酸及纯化实验二目的DNA分子的PCR扩增、染色检测与分析5实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳检测10.12实验四1DNA分子的聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染分析2
2 目 录 实验一 CTAB 法分离植物组织总核酸及纯化.3 实验二 目的 DNA 分子的 PCR 扩增、染色检测与分析 .5 实验三 DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测.10 实验四 DNA 分子的聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染分析.12
实验一CTAB法分离植物组织总核酸及纯化1实验目的分离和制备符合基因操作实验所用的高质量DNA分子。2实验原理植物细胞中DNA位于细胞核和细胞质中，分离植物总DNA首先要破碎细胞壁，然后用SDS、CTAB、PEX等试剂裂解细胞膜系统，释放DNA到DNA提取介质中。然后使DNA与蛋白质、多糖、多酚类物质分开，在乙醇或异丙醇作用下沉淀DNA。3实验材料与试剂：实验材料：高粱叶片实验用仪器：高速冷冻离心机、水浴锅、移液器、离心管（2mL.1.5mL）、吸头（1mL.200uL10uL)。试剂：CTAB、NaCI、EDTA、Tris.base、β-巯基乙醇、异丙醇、醋酸钠。试剂的配置：（1）DNA提取缓冲液(DNAextractionbuffer)①1×CTAB提取缓冲液2×CTAB提取缓冲液50mmol/L TrisCI pH 8.0100 mmol/LTris.Cl pH8.00.7mol/LNaCI1.4 mol/L NaCI10mmol/LEDTA20mmol/LEDTA1% CTAB2%CTAB0.1~2%β-筑基乙醇0.1~2%β-巯基乙醇玉米CTAB提取缓冲液（来源于CIMMYT）终浓度储存液50 mL100mL200mLddHO32.5 mL65.0 mL130.0 mL1 M Tris-7.5100mmol/L5.0 mL10.0mL20.0 mL700mmol/L5 M NaCI7.0 mL14.0mL28.0mL0.5MEDTA-8.050 mmol/L5.0mL10.0 mL20.0 mLCTAB?1 %0.5 g1.0 g2.0 g14 M BME3140mmol/L0.5mL1.0 mL2.0mLUse freshly made; warm buffer to 60-65°C before adding the CTAB and BME12.CTAB=Mixed alkyltrimethyl-ammonium bromide (Sigma M-7635)Add BME (β-mercaptoethanol) just prior to use, under a fume hood.3.②SDS提取缓冲液100 mmol/LTris.CI pH 8.0100mmol/LNaCl50mmol/LEDTA2% SDS(2)1×TE:10 mmol/L Tris.CI pH8.0;1mmol/LEDTApH8.03
3 实验一 CTAB 法分离植物组织总核酸及纯化 1 实验目的 分离和制备符合基因操作实验所用的高质量 DNA 分子。 2 实验原理 植物细胞中 DNA 位于细胞核和细胞质中，分离植物总 DNA 首先要破碎细胞壁，然后用 SDS、CTAB、PEX 等试剂裂解细胞膜系统，释放 DNA 到 DNA 提取介质中。然后使 DNA 与蛋白质、多糖、多酚类物质分开，在乙醇或异丙醇作用下沉淀 DNA。 3 实验材料与试剂： 实验材料：高粱叶片 实验用仪器：高速冷冻离心机、水浴锅、移液器、离心管（2mL,1.5mL）、吸头（1mL, 200uL, 10uL）。 试剂：CTAB、NaCl、EDTA、Tris.base、β-巯基乙醇、异丙醇、醋酸钠。 试剂的配置： （1）DNA 提取缓冲液 (DNA extraction buffer) ① 1× CTAB 提取缓冲液 2×CTAB 提取缓冲液 50 mmol/L TrisCl pH 8.0 100 mmol/L Tris.Cl pH 8.0 0.7 mol/L NaCl 1.4 mol/L NaCl 10 mmol/L EDTA 20 mmol/L EDTA 1% CTAB 2% CTAB 0.1~2% β-巯基乙醇 0.1~2% β-巯基乙醇 玉米 CTAB 提取缓冲液 1（来源于 CIMMYT） 储存液 终浓度 50 mL 100 mL 200 mL ddH2O 32.5 mL 65.0 mL 130.0 mL 1 M Tris-7.5 100 mmol/L 5.0 mL 10.0 mL 20.0 mL 5 M NaCl 700 mmol/L 7.0 mL 14.0 mL 28.0 mL 0.5 M EDTA-8.0 50 mmol/L 5.0 mL 10.0 mL 20.0 mL CTAB2 1 % 0.5 g 1.0 g 2.0 g 14 M BME3 140 mmol/L 0.5 mL 1.0 mL 2.0 mL 1． Use freshly made; warm buffer to 60-65°C before adding the CTAB and BME. 2． CTAB = Mixed alkyltrimethyl-ammonium bromide (Sigma M-7635). 3． Add BME (β-mercaptoethanol) just prior to use, under a fume hood. ② SDS 提取缓冲液 100 mmol/L Tris.Cl pH 8.0 100 mmol/L NaCl 50 mmol/L EDTA 2 % SDS （2）1×TE： 10 mmol/L Tris.Cl pH8.0； 1 mmol/L EDTA pH8.0
(3)3mol/LNaOAcpH5.2;（4）预冷的异丙醇注：【CTAB：十六烷基三甲基溴化铵、SDS：十二烷基磺酸钠、BME：β巯基乙醇，抗氧化剂（抗坏血酸钠、磷酸吡哆醛PVP))4实验操作步骤：1)植物叶片2~3g在液氮中研磨，装如2mL离心管中。2)加800uL提取缓冲液，充分混匀。3)65℃水浴60min，每隔15min混匀一次，应避免剧烈晃动。4)冷却到室温后加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，充分混匀15min。5)8000rpm离心20min。6)取上清，加等体积的氯仿/异戊醇（24:1），充分混匀。7)8000rpm离心20min。8)取上清，加1/10体积的3mol/LNaOAc(pH5.2)，0.8×体积预冷的异丙醇，混匀，置-20℃1h。勾出或10000rpm离心20min，沉淀DNA。9)10）70%酒精洗沉淀2次。11）风干DNA样品，加适量TE溶解DNA，置-20℃备用。12）取适量DNA，琼脂糖琼脂糖凝胶电泳检测。5作业：（1）用CTAB方法制备植物DNA的操作过程中应注意那些事项？（2）DNA提取液中各种成分如SDS、CTAB、EDTA、NaCI、β-筑基乙醇等的作用是什么？（3）根据你所制备的DNA的琼脂糖琼脂糖凝胶电泳检测结果（附图），分析提取的DNA质量如何？有无降解？如有降解（在泳道中可见弥散状DNA），请分析可能产生的原因。根据实验3中提供的方法，估算所制备的DNA样品的量。4
4 （3）3mol/L NaOAc pH 5.2 ； （4） 预冷的异丙醇 注：【CTAB：十六烷基三甲基溴化铵、SDS：十二烷基磺酸钠、BME：β 巯基乙醇，抗 氧化剂（抗坏血酸钠、磷酸吡哆醛 PVP）】 4 实验操作步骤： 1) 植物叶片 2~3g 在液氮中研磨, 装如 2mL 离心管中。 2) 加 800 uL 提取缓冲液, 充分混匀。 3) 65℃ 水浴 60 min，每隔 15min 混匀一次，应避免剧烈晃动。 4) 冷却到室温后加等体积的酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1), 充分混匀 15min。 5) 8 000rpm 离心 20min。 6) 取上清, 加等体积的氯仿/异戊醇 (24:1), 充分混匀。 7) 8 000 rpm 离心 20 min。 8) 取上清, 加 1/10 体积的 3 mol/L NaOAc (pH5.2), 0.8×体积预冷的异丙醇, 混匀, 置 -20 ℃ 1h。 9) 勾出或 1 0000 rpm 离心 20min, 沉淀 DNA。 10) 70% 酒精洗沉淀 2 次。 11) 风干 DNA 样品, 加适量 TE 溶解 DNA, 置 -20 ℃ 备用。 12) 取适量 DNA，琼脂糖琼脂糖凝胶电泳检测。 5 作业： （1）用 CTAB 方法制备植物 DNA 的操作过程中应注意那些事项？ （2） DNA 提取液中各种成分如 SDS、CTAB、EDTA、NaCl、β-巯基乙醇等的作用是什么？ （3） 根据你所制备的 DNA 的琼脂糖琼脂糖凝胶电泳检测结果（附图），分析提取的 DNA 质量如何？有无降解？如有降解（在泳道中可见弥散状 DNA），请分析可能产生的原因。根 据实验 3 中提供的方法，估算所制备的 DNA 样品的量
实验二目的DNA分子的PCR扩增、染色检测与分析1实验目的通过该实验掌握PCR反应原理，PCR操作的基本步骤以及对PCR反应结果的检测分析。2实验原理1.1聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3'末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的折增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合酶、Mg*等。（1）模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。（2）模板DNA与引物的退火将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。退火时间一般为1~2min。（3）引物的延伸DNA模板-引物复合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，TaqDNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。1.2PCR反应的五个元素参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg。引物：引物设计应遵循以下原则：（1）引物长度。长度要求在15～30bp，常用为20bp左右，引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，且合成长引物还会使费用大大增加。（2）引物碱基构成。引物的G+C含量以40～60%为宜，因为G+C含量过高或过低都会5
5 实验二 目的 DNA 分子的 PCR 扩增、染色检测与分析 1 实验目的 通过该实验掌握 PCR 反应原理，PCR 操作的基本步骤以及对 PCR 反应结果的检测分析。 2 实验原理 1.1 聚合酶链式反应（PCR）的基本构成 PCR 基本原理是以单链 DNA 为模板，4 种 dNTP 为底物，在模板 3’末端有引物存在的 情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板 DNA 得到极大程度的扩 增。在微量离心管中，加入与待扩增的 DNA 片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量 的缓冲液、微量的 DNA 膜板、四种 dNTP 溶液、耐热 Taq DNA 聚合酶、Mg2+等。 （1）模板 DNA 的变性 模板 DNA 加热到 90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为 DNA 的变性。变性温度与 DNA 中 G-C 含量有关，G-C 间由三个氢键连接，而 A-T 间只有两个氢 键相连，所以 G-C 含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故 PCR 中 DNA 变性需要的温 度和时间与模板 DNA 的二级结构的复杂性、G-C 含量高低等均有关。 （2）模板 DNA 与引物的退火 将反应混合物温度降低至 37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成 DNA 模板- 引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基 组成。退火时间一般为 1~2 min。 （3）引物的延伸 DNA 模板-引物复合物在 Taq DNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模 板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板 DNA 链互补的新链。延伸所需要的时 间取决于模板 DNA 的长度。在 72℃条件下，Taq DNA 聚合酶催化的合成速度大约为 40～60 个碱基/秒。 1.2 PCR 反应的五个元素 参与 PCR 反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+。 引物：引物设计应遵循以下原则： （1）引物长度。长度要求在 15～30bp，常用为 20bp 左右，引物过短时会造成 Tm 值过 低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成 Tm 值过高，超过酶反应 的最适温度，且合成长引物还会使费用大大增加。 （2）引物碱基构成。引物的 G+C 含量以 40～60%为宜，因为 G+C 含量过高或过低都会
直接造成Tm值的过高或过低，都不利PCR反应的进行。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。（3）引物二级结构。应尽量避免引物内部出现二级结构，并且两条引物间不能形成互补结构，特别是3"端的互补，否则形成引物二聚体，PCR扩增中产生非特异的条带。引物自身也应无回文对称结构（限制性酶切位点除外），防止形成茎环结构。（4）引物3端序列。3端碱基要求与模板严格配对，连续配对的碱基数超过15bp，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。（5）引物中酶切位点的引入。引物中一般会引入一至两个酶切位点，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中，PCR克隆基因时已将后续方案设计完毕。（6）引物的特异性。引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性，特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。（7）引物量。反应体系中引物的常用浓度为0.1～1pmol/mL，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会在反应过程中形成二聚体，过低则扩增效率会降低。酶及其浓度：TaqDNA多聚酶是耐热DNA聚合酶，是从水生栖热菌（Thermusaquaticus）中分离的。具有5→3"的聚合酶活力，5°-→3的外切核酸酶活力，无3°→5的外切核酸酶活力，会在3末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（通常为A，故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体），在体外实验中，TaqDNA聚合酶的出错率为10-～10。此酶具有以下特点：（1）耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性在90%以上，在93℃下反应2h后其残留活性是仍能保持60%，而在95℃下反应2h后为原来的40%。（2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。（3）一般扩增的PCR产物长度可达2.0kb，且特异性也较高。一典型的PCR反应约需的酶量为1U（总反应体积为25uL时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度：在PCR反应中，dNTP应为50～200μumol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg*结合，使游离的Mg*浓度降低。模板DNA6
6 直接造成 Tm 值的过高或过低，都不利 PCR 反应的进行。ATGC 最好随机分布，避免 5 个以 上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 （3）引物二级结构。应尽量避免引物内部出现二级结构，并且两条引物间不能形成互补 结构，特别是 3’端的互补，否则形成引物二聚体，PCR 扩增中产生非特异的条带。引物自身 也应无回文对称结构（限制性酶切位点除外），防止形成茎环结构。 （4）引物 3’端序列。3’端碱基要求与模板严格配对，连续配对的碱基数超过 15bp，以 避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。 （5）引物中酶切位点的引入。引物中一般会引入一至两个酶切位点，便于后期的克隆实 验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中，PCR 克隆基因时已将后续方案设计完 毕。 （6）引物的特异性。引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性，特别是与待扩 增的模板 DNA 之间要没有明显的相似序列。 （7）引物量。反应体系中引物的常用浓度为 0.1～1pmol/mL，以最低引物量产生所需要 的结果为好，引物浓度偏高会在反应过程中形成二聚体，过低则扩增效率会降低。 酶及其浓度： Taq DNA 多聚酶是耐热 DNA 聚合酶，是从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离的。 具有 5’→3’的聚合酶活力，5’ →3’的外切核酸酶活力，无 3’ →5’的外切核酸酶活力，会在 3’ 末端不依赖模板加入 1 个脱氧核苷酸（通常为 A，故 PCR 产物克隆中有与之匹配的 T 载体）， 在体外实验中，Taq DNA 聚合酶的出错率为 10-4～10-5。此酶具有以下特点： （1）耐高温，在 70℃下反应 2h 后其残留活性在 90%以上，在 93℃下反应 2h 后其残留 活性是仍能保持 60%，而在 95℃下反应 2h 后为原来的 40%。 （2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。 （3）一般扩增的 PCR 产物长度可达 2.0 kb，且特异性也较高。 一典型的 PCR 反应约需的酶量为 1U（总反应体积为 25uL 时），浓度过高可引起非特异 性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP 的质量与浓度： 在 PCR 反应中，dNTP 应为 50～200μmol/L，尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等（等 摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过 低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。 模板 DNA
模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理样本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂（酚与氯仿抽）抽提除去蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸，该核酸即可作为模板用于PCR反应。模板DNA投入量对于细菌基因组DNA一般在1~1Ong/uL，实验中模板浓度常常需要优化，一般可选择几个浓度梯度（浓度差以10倍为一个梯度）。在PCR反应中，过高的模板量往往会导致PCR实验的失败。Mg*浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，Mg+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。1.3PCR反应条件温度与时间的设置：标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。1.4PCR反应特点（1）强特异性PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异性的结合：②碱基配对原则③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性：④靶基因的特异性与保守性。（2）高灵敏度PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-2g）量级的起始待测模板扩增到微克（ug=10~g）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。（3）快速简便PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR仪上进行7
7 模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通 常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理样本。SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白 质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂（酚与氯仿抽） 抽提除去蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸，该核酸即可作为模板用于 PCR 反应。 模板 DNA 投入量对于细菌基因组 DNA 一般在 1~10ng/uL，实验中模板浓度常常需要优 化，一般可选择几个浓度梯度（浓度差以 10 倍为一个梯度）。在 PCR 反应中，过高的模板量 往往会导致 PCR 实验的失败。 Mg2+浓度 Mg2+ 对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中， Mg2+浓度为 1.5～2.0 mmol/L 为宜。Mg2+ 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降 低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。 1.3 PCR 反应条件 温度与时间的设置：标准反应中采用三温度点法，双链 DNA 在 90～95℃变性，再迅速 冷却至 40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至 70～75℃，在 Taq DNA 聚 合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。 1.4 PCR 反应特点 （1）强特异性 PCR 反应的特异性决定因素为： ① 引物与模板 DNA 特异性的结合； ② 碱基配对原则； ③ Taq DNA 聚合酶合成反应的忠实性； ④ 靶基因的特异性与保守性。 （2）高灵敏度 PCR 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg =10-12 g）量级的起始待测模板扩 增到微克（ug = 10-6 g）水平。能从 100 万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达 3 个 RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为 3 个细菌。 （3）快速简便 PCR 反应用耐高温的 Taq DNA 聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在 PCR 仪上进行
变性一退火一延伸反应，反应一般在2～4h完成。扩增产物常用电泳分析，操作简单易推广，如采用特殊PCR仪（荧光实时定量PCR仪）则可全程监测PCR反应的结果，故耗时将更短。（4）低纯度模板DNA粗制品及总RNA等均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。1.5PCR结果异常分析（1）非特异性扩增产物的出现背景DNA与引物同源性高。可通过在两个引物的内侧序列上再使用另外一对对扩增产物DNA再次进行PCR扩增。退火温度太低。引物和模板的配对是一个动态过程，分子的热运动使引物与模板结合与解离而达到最佳配对位点上。退火温度太低，造成引物与模板的非特异性位点部分配对而解离不下来，这种不正确的配对，进入PCR反应过程就可扩增出非特异性的产物DNA。提高退火的温度将可改善结果。过量的酶、引物和模板DNA可使PCR反应造成混乱，强行扩增出非特异性产物DNA适当降低这些试剂的量有助于问题的解决。（2）无特异性扩增产物带①引物溶液反复冻融或污染了DNA酶类，造成引物降解。②模板DNA制备时模板已降解。③Taq酶有失活或有杂酶污染。④缓冲液条件不当。③引物不正确。3试剂与器材：（1）试剂：（1）模板DNA（10个不同的高梁品种DNA样本）（2）TaqDNA聚合酶（3）10×缓冲液(4）dNTP（25mmol/L)(5）引物(2umol/L)（2）器材0.2mLeppendorf管（PCR专用薄壁管），0.5mL离心管或1.5mL离心管；移液器吸头（10uL，200uL）移液器；离心机（PCR反应液混合后离心）；8
8 变性－退火－延伸反应，反应一般在 2～4h 完成。扩增产物常用电泳分析，操作简单易推广， 如采用特殊 PCR 仪（荧光实时定量 PCR 仪）则可全程监测 PCR 反应的结果，故耗时将更短。 （4）低纯度模板 DNA 粗制品及总 RNA 等均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽 液、毛发、细胞、活组织等粗制的 DNA 扩增检测。 1.5 PCR 结果异常分析 （1）非特异性扩增产物的出现 背景 DNA 与引物同源性高。可通过在两个引物的内侧序列上再使用另外一对对扩增产 物 DNA 再次进行 PCR 扩增。 退火温度太低。引物和模板的配对是一个动态过程，分子的热运动使引物与模板结合与 解离而达到最佳配对位点上。退火温度太低，造成引物与模板的非特异性位点部分配对而解 离不下来，这种不正确的配对，进入 PCR 反应过程就可扩增出非特异性的产物 DNA。提高 退火的温度将可改善结果。 过量的酶、引物和模板 DNA 可使 PCR 反应造成混乱，强行扩增出非特异性产物 DNA， 适当降低这些试剂的量有助于问题的解决。 （2）无特异性扩增产物带 ① 引物溶液反复冻融或污染了 DNA 酶类，造成引物降解。 ② 模板 DNA 制备时模板已降解。 ③ Taq 酶有失活或有杂酶污染。 ④ 缓冲液条件不当。 ⑤ 引物不正确。 3 试剂与器材： （1）试剂： (1) 模板 DNA (10 个不同的高粱品种 DNA 样本) （2）Taq DNA 聚合酶 （3）10×缓冲液 （4）dNTP（25 mmol/L） （5）引物 (2 umol/L) （2）器材 0.2mL eppendorf 管（PCR 专用薄壁管），0.5 mL 离心管或 1.5 mL 离心管； 移液器吸头（10uL, 200uL）； 移液器； 离心机（PCR 反应液混合后离心）；
PCR仪；超净工作台提供洁净操作区用于PCR加样。4实验步骤（1）取10只PCR反应管，并编号。（2）取一只0.5mL离心管，如下体积加样配制11个PCR反应：1个反应11个反应总体积20uLddH2010.24uL112.64uL2uL10xbuffer22 uLMgCl21.6 uL17.6uLdNTP (25mmol)0.16uL1.76 uL2uLPrimerl (2umol/L)22 uL2uL22 uLPrimer2（2umol/L)2uL模版DNA（20ng/uL）--Tag酶（5U/uL)0.2 uL2.2 uL10个反应，按11个反应配制反应混合液（多余一个用于损耗），混匀，然后分装到10个PCR反应管中，每个管加2uL模版DNA，如果引物不同，也分别加入。向每个管中加半滴矿物油，盖好盖。（3）按下列PCR条件进行反应：94℃5min94℃30s37℃50s30个循环72℃Imin72℃5min4℃10hs（4）PCR扩增结束后，取出扩增样本，每个管中加5uL加样缓冲液，0.8%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪下观察照相。5作业：1）分析PCR反应体系中各成分对扩增结果的影响。2）如果扩增结果不理想或无扩增，如何查找原因？3）附实验结果图并对结果做必要的分析。9
9 PCR 仪； 超净工作台提供洁净操作区用于 PCR 加样。 4 实验步骤 （1）取 10 只 PCR 反应管，并编号。 （2）取一只 0.5mL 离心管，如下体积加样配制 11 个 PCR 反应： 1 个反应 11 个反应 总体积 20uL ddH2O 10.24uL 112.64 uL 10×buffer 2uL 22 uL MgCl2 1.6 uL 17.6 uL dNTP（25mmol） 0.16uL 1.76 uL Primer1（2umol/L） 2uL 22 uL Primer2（2umol/L） 2uL 22 uL 模版 DNA（20ng/uL） 2uL - Taq 酶（5U/uL） 0.2 uL 2.2 uL 10 个反应，按 11 个反应配制反应混合液（多余一个用于损耗），混匀，然后分装到 10 个 PCR 反应管中，每个管加 2uL 模版 DNA，如果引物不同，也分别加入。向每个管中加半 滴矿物油，盖好盖。 （3）按下列 PCR 条件进行反应： 94℃ 5min 94℃ 30s 37℃ 50s 30 个循环 72℃ 1min 72℃ 5min 4℃ 10hs （4）PCR 扩增结束后，取出扩增样本，每个管中加 5uL 加样缓冲液， 0.8% 琼脂糖凝胶电 泳，凝胶成像仪下观察照相。 5 作业： 1）分析 PCR 反应体系中各成分对扩增结果的影响。 2）如果扩增结果不理想或无扩增，如何查找原因 ？ 3）附实验结果图并对结果做必要的分析
实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳检测1实验目的①检测制备的DNA质量。②检测PCR反应产物。2实验原理琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过糖苷键交替构成的线状聚合物，形成直径为50nm到200nm的三维筛孔通道。在电场作用下，DNA分子在琼脂糖中迁移。通过EB染色可以检测DNA的分子大小及质量，可定量、定性地对DNA分子进行分析。3实验用试剂与仪器试剂：①5xTBE（电泳缓冲液）（54gTris，27.5g硼酸，20mL0.5mol/LEDTA，定容到1000mL），使用液为0.5×。②6×加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）。注：溴酚蓝在0.5%~1.4%琼脂糖凝胶中约与300bp的dsDNA的迁移率相同（在0.5×TBE中）。③琼脂糖④漠化乙锭（EB），10mg/mL，使用时终浓度为0.5ug/mL。③DNA样本：a:CTAB法或其他方法制备的总DNA。b:PCR扩增产物。仪器：电泳槽、电泳仪、移液器、移液器吸头。4方法步骤：（1）配制琼脂糖凝胶①0.7%琼脂糖凝胶配制。称取0.35g琼脂糖，放入100mL锥形瓶中，加入50mL0.5×TBE缓冲液，于微波炉或电炉加热溶解（沸腾），注意加热时防止液体溢出。②冷却至60℃左右，加入2.5uLEB，终浓度为0.5ug/mL，混匀。③将凝胶床水平放置，插入两端的挡板，用滴管吸取少量的凝胶封好胶床边缘放入梳子，使梳齿高于底板0.5~1.0mm。③倒入琼脂糖凝胶溶液，其厚度为3~5mm，放置30～60min，使胶完全硬化。③去掉两端的挡板，将胶床放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，液面高出胶面1~2mm。小心拔出梳子，检查样品孔是否完整。(2)加样①提取DNA的质量检测取1~5uLDNA样品，与加样缓冲液于封口膜上混合。用20uL的移液器将样品加入样品孔内。操作时，可用右手持移液器，左手握住右手腕，10
10 实验三 DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测 1 实验目的 ① 检测制备的 DNA 质量。 ② 检测 PCR 反应产物。 2 实验原理 琼脂糖是 D-和 L-半乳糖残基通过糖苷键交替构成的线状聚合物，形成直径为 50nm 到 200nm 的三维筛孔通道。在电场作用下，DNA 分子在琼脂糖中迁移。通过 EB 染色可以检测 DNA 的分子大小及质量，可定量、定性地对 DNA 分子进行分析。 3 实验用试剂与仪器 试剂：① 5×TBE（电泳缓冲液）（54g Tris，27.5g 硼酸，20mL 0.5mol/L EDTA，定容到 1000 mL），使用液为 0.5×。 ② 6× 加样缓冲液 （0.25% 溴酚蓝, 40% 蔗糖水溶液）。注：溴酚蓝在 0.5%~1.4% 琼 脂糖凝胶中约与 300bp 的 dsDNA 的迁移率相同（在 0.5×TBE 中）。 ③ 琼脂糖 ④ 溴化乙锭（EB），10mg/mL, 使用时终浓度为 0.5ug/mL。 ⑤ DNA 样本：a: CTAB 法或其他方法制备的总 DNA。b: PCR 扩增产物。 仪器： 电泳槽、电泳仪、移液器、移液器吸头。 4 方法步骤： （1） 配制琼脂糖凝胶 ① 0.7% 琼脂糖凝胶配制。称取 0.35g 琼脂糖，放入 100mL 锥形瓶中，加入 50 mL 0.5×TBE 缓冲液，于微波炉或电炉加热溶解（沸腾），注意加热时防止液体溢出。 ② 冷却至 60℃左右，加入 2.5uL EB, 终浓度为 0.5ug／mL，混匀。 ③ 将凝胶床水平放置，插入两端的挡板，用滴管吸取少量的凝胶封好胶床边缘。 ④ 放入梳子，使梳齿高于底板 0.5～1.0mm。 ⑤ 倒入琼脂糖凝胶溶液，其厚度为 3～5mm，放置 30～60min，使胶完全硬化。 ⑥ 去掉两端的挡板，将胶床放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，液面高出胶面 1~2mm。 小心拔出梳子，检查样品孔是否完整。 （2） 加样 ① 提取 DNA 的质量检测 取 1~5uL DNA 样品，与加样缓冲液于封口膜上混合。 用 20uL 的移液器将样品加入样品孔内。操作时，可用右手持移液器，左手握住右手腕