生物分离工程实验实验指导书
生物分离工程实验 实验指导书
目录-实验一PEG/(NH4)2SO4两水相系统的相图实验二两水相系统中蛋白质分配系数的测定..4实验三考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量...6.8实验四双水相萃取α-淀粉酶的分配平衡实验
目 录 实验一 PEG/(NH4)2SO4 两水相系统的相图. 1 实验二 两水相系统中蛋白质分配系数的测定. 4 实验三 考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量. 6 实验四 双水相萃取α-淀粉酶的分配平衡实验. 8
实验一PEG/（NH4）2SO4两水相系统的相图一、实验目的和要求1.了解双水相萃取的原理和发展历史、趋势2.掌握用浊点法制作双水相系统相图的方法，加深对相图的认识。二、实验原理两种亲水性高聚物或高聚物与无机盐在水中会形成两个相，这是由于高聚物的不相溶性或盐析作用而引起的，但是它们只有达到一定的浓度时，才能形成两相。两水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是一根双节线，当成相组分的配比取在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后，溶液澄清透明，称为均相区：在曲线的上方时，能自动分为两相，称为两相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为浑浊。相图是研究两水相萃取的基础。连接双节线上的两点的直线称为系线，它由三点确定，即M（初始混合物组成情况）、T（上相组成情况）、B（下相组成情况），其中T/B互为共相。系线越长，两相间的差别越大，当系线长度趋向零时，两相差别消失。系线上系统的总浓度不同，但均分成组成相同体积不同的两相，两相体积服从杠杆规则：VTVB=BM/MT城200d10aMK股量分数/%三、实验器材与试剂1.器材电子台秤，旋涡混合器，三角瓶（50mL）或大试管（20mL），25mL微量滴定管装置。2.试剂聚乙二醇400（PEG400），聚乙二醇4000（PEG4000），聚乙二醇8000（PEG8000），硫酸铵。四、操作方法1.溶液配制配制43.00%（g/m1)的（NH)S0,溶液：精确称取（NH）2S0固体430.0g少量水溶解后稀释到1000ml，并用密度计测定其密度。43.00%（g/m1）的（NH），S0溶液的密度为1.2g/mL。液体聚乙二醇PEG400可用纯溶液，固体PEG需配制成40%的聚乙二醇溶液。1
1 实验一 PEG/(NH4)2SO4两水相系统的相图 一、实验目的和要求 1.了解双水相萃取的原理和发展历史、趋势 2. 掌握用浊点法制作双水相系统相图的方法，加深对相图的认识。 二、实验原理 两种亲水性高聚物或高聚物与无机盐在水中会形成两个相，这是由于高聚物的不相溶性或盐析作用而 引起的，但是它们只有达到一定的浓度时，才能形成两相。两水相形成的条件和定 量关系可用相图来表 示，它是一根双节线，当成相组分的配比取在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后，溶液澄清透明， 称为均相区；在曲线的上方时，能自动分为两相，称为两相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好 从澄清变为浑浊。相图是研究两水相萃取的基础。 连接双节线上的两点的直线称为系线，它由三点确定,即 M(初始混合物组成情况)、T(上相组成情况)、 B(下相组成情况)，其中 T/B 互为共扼相。系线越长，两相间的差别越大，当系线长度趋向零时，两相差 别消失。系线上系统的总浓度不同，但均分成组成相同体积不同的两相，两相体积服从杠杆规则：ＶＴ／ ＶＢ＝ＢＭ／ＭＴ 三、实验器材与试剂 1.器材 电子台秤，旋涡混合器，三角瓶（50mL）或大试管(20 mL)，25mL 微量滴定管装置。 2.试剂 聚乙二醇 400(PEG400)，聚乙二醇 4000(PEG4000)，聚乙二醇 8000(PEG8000)，硫酸铵。 四、操作方法 1.溶液配制 配制 43.00％(g／m1)的(NH4)2SO4溶液：精确称取(NH4)2SO4固体 430.0g 少量水溶解后稀释到 1 000 m1， 井用密度计测定其密度。43.00％(g／m1)的(NH4)2SO4溶液的密度为 1.2g/mL。 液体聚乙二醇PEG400可用纯溶液，固体PEG需配制成40%的聚乙二醇溶液
2.相图的制作精确称取PEG400液体0.700g左右于50mL三角瓶中，按表1中所列第1号数据，加入0.5mL去离子水（H20的密度以1g/m1计），用滴定管缓慢滴加已配好的（NH)2SO溶液，并不断在旋涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管或三角瓶内溶液开始出现浑浊为止。记录硫酸铵溶液的加量（m1），根据密度值求出质量（g）。然后，按表格所列第2号数据加入水，溶液澄清（加水量根据点子的密集程度控制)，继续向试管或三角瓶中滴加硫酸铵溶液并不断混匀，直至再次达到浑浊，如此反复操作；计算每次达到浑浊时，PEG和（NH)SO在系统总量中的质量分数（g/g），将实验数据填入表1中，用温度计测量溶液的温度。以PEG的质量分数为纵坐标，（NH)SO.的质量分数为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。H20PEG400H20记录0.700g(NH4)2SO40.3/0.5m0.5m混和(NH)SO1mL数A4混均浑浊澄清旋涡器表1相图制作表℃PEG400=温度t=g编号(NH.) 2S04溶液累PEG400(NH.) 2S04Hz0纯(NH)2S04计量加量累计量质量分数溶液加量质量分数/%/g/mL/g/g/%/g10.520.330.340.350.560.50.57注：如果实验室的电子台秆（精确至0.01g）能做到每组1台，也可采用在电子台秤上称取质量的方式来加（NH），SO.溶液，这样就不需通过密度转换，更直观。3.实验数据的计算公式（1）43%(NH4)SO,溶液密度=1.2g/mL（2）(NH4)SO4溶液加量/g=(NH4)SO4溶液滴定体积X(NH4)SO4溶液密度2
2 2.相图的制作 精确称取 PEG400 液体 0.700g 左右于 50mL 三角瓶中，按表 1 中所列第 1 号数据，加入 0.5 mL 去离子 水(H20 的密度以 1g／m1 计)，用滴定管缓慢滴加已配好的(NH4)2SO4溶液，并不断在旋涡混合器上混合，观 察溶液的澄清程度，直至试管或三角瓶内溶液开始出现浑浊为止。 记录硫酸铵溶液的加量(m1)，根据密度值求出质量(g)。然后，按表格所列第 2 号数据加入水，溶液 澄清(加水量根据点子的密集程度控制)，继续向试管或三角瓶中滴加硫酸铵溶液并不断混匀，直至再次达 到浑浊，如此反复操作；计算每次达到浑浊时，PEG 和(NH4)2SO4 在系统总量中的质量分数(g／g)，将实验 数据填入表 1 中，用温度计测量溶液的温度。以 PEG 的质量分数为纵坐标，(NH4)2SO4的质量分数为横坐 标作图，即得到一条双节线的相图。 表 1 相图制作表 PEG400= g 温度 t= ℃ 编号 H2O 加量 /g (NH4)2SO4 溶液加量 纯(NH4)2SO4 累计量 /g 溶液累 计量 /g PEG400 质 量 分 数 /% (NH4)2SO4 质 量 分 数 /mL /g /% 1 0.5 2 0.3 3 0.3 4 0.3 5 0.5 6 0.5 7 0.5 注：如果实验室的电子台秆(精确至 0.01g)能做到每组 1 台，也可采用在电子台秤上称取质量的方式 来加(NH4)2SO4溶液，这样就不需通过密度转换，更直观。 3.实验数据的计算公式 （1） 43% (NH4)2SO4 溶液密度=1.2g/mL （2） (NH4)2SO4 溶液加量/g=(NH4)2SO4 溶液滴定体积×(NH4)2SO4溶液密度 PEG400 0.700g H2O 0.5m L (NH4)2SO4 混和 H2O 0.3/0.5m L 浑浊 记录 (NH4)2SO4 mL数 混均 澄清 旋涡器
（3）纯（NH）2S0.累计量/g=(NH4)2SO4溶液滴定累积体积×43%(4）溶液累计量/g=(NH4)2SO4溶液加量/g+H2O量/g+PEG/g（5）PEG400质量分数/%=0.7gPEG量一溶液累计量/gX100%（6）（NH4)2SO4质量分数/%=纯（NH）2S0累计量一溶液累计量/g×100%五、实验结果和讨论1.将实验结果列入表格，并作出相图。六、注意事项1.微量滴定管在使用前必须先洗涤干净，否则容易产生气泡或发生堵塞现象。洗涤时，不用去污粉可用铬酸洗液或洗涤液先浸泡一段时间后，用一根细长的刻度移液管刷刷洗刻度处，最后用蒸馏水反复冲洗数次。2.清洗干净的微量滴定管必须先用蒸馏水试漏，如有漏液，可涂少量凡士林（过量的凡士林会堵塞滴定管）。试漏成功的滴定管要润洗两次，即注液杯、支管、刻度管和出液尖嘴用滴定液洗涤两遍，3.由于支管拐弯处易藏气泡，一般待滴定液放满刻度管后打开支管旋塞用洗耳球将溶液中气泡刚好吹入贮液杯中即可，也可缓慢倾斜滴定管使气泡从口部溢出。4.滴定过程要注意爱护仪器，轻拿轻放。用（NH)2SO.滴定时，在接近滴定终点左右时一定要每滴一滴，便彻底混匀后方可滴定下一滴。七、思考题1.双水相萃取中相图有何意义？2.双水相萃取在分离生物大分子物质时有何意义？
3 （3） 纯(NH4)2SO4累计量/g=(NH4)2SO4 溶液滴定累积体积×43% （4） 溶液累计量/g= (NH4)2SO4 溶液加量/g+H2O 量/g+PEG/g （5） PEG400 质量分数/%=0.7gPEG 量÷溶液累计量/g×100% （6）(NH4)2SO4 质量分数/%=纯(NH4)2SO4累计量÷溶液累计量/g×100% 五、实验结果和讨论 1．将实验结果列入表格，并作出相图。 六、注意事项 1.微量滴定管在使用前必须先洗涤干净，否则容易产生气泡或发生堵塞现象。洗涤时，不用去污粉， 可用铬酸洗液或洗涤液先浸泡一段时间后，用一根细长的刻度移液管刷刷洗刻度处，最后用蒸馏水反复冲 洗数次。 2.清洗干净的微量滴定管必须先用蒸馏水试漏，如有漏液，可涂少量凡士林（过量的凡士林会堵塞滴 定管）。试漏成功的滴定管要润洗两次，即注液杯、支管、刻度管和出液尖嘴用滴定液洗涤两遍。 3.由于支管拐弯处易藏气泡，一般待滴定液放满刻度管后打开支管旋塞用洗耳球将溶液中气泡刚好吹 入贮液杯中即可，也可缓慢倾斜滴定管使气泡从口部溢出。 4.滴定过程要注意爱护仪器，轻拿轻放。用(NH4)2SO4滴定时，在接近滴定终点左右时一定要每滴一滴， 便彻底混匀后方可滴定下一滴。 七、思考题 1.双水相萃取中相图有何意义？ 2.双水相萃取在分离生物大分子物质时有何意义？
实验二两水相系统中蛋白质分配系数的测定一、实验目的和要求掌握蛋白质在两水相系统中分配系数的测定方法。二、实验原理在两水相系统中，生物大分子物质与成相组分之间通过疏水键、氢键和离子键等相互作用而不同程度地分配在两相中，当萃取达到平衡时，蛋白质在上、下两相中的浓度之比，称为分配系数K，可用下式表示：K=c/c2 (2-1)式中：c——表示平衡状态下，上相蛋白质的浓度C2——表示平衡状态下，下相蛋白质的浓度相比：上下相体积比称为相比R=V/V下本实验以糖化酶为实验对象，在PEG/(NH)SO.两水相系统中进行分配，糖化酶为生物大分子蛋白，是黑曲霉经发酵制得的，糖化酶广泛用于酒、醋、味精等发酵工业中起糖化作用，能将淀粉转化为葡萄糖。用考马斯亮兰（CBBG-250)比色法分别测定上下相中总蛋白的含量，求分配系数。CBBG-250是一种染料，酸性溶液中呈棕红色，与蛋白质通过范德华键结合成蓝色复合物，595nm波长有最大吸收值。低浓度（0.01～~1.0mg/mL）时，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。三、实验器材与试剂1.器材电于台秤，10mL刻度离心试管，台式离心机，移液管或町调式移液器，小滴管，50ml容量瓶和试管等。2.试剂糖化酶（2万U/mL左右，使用前用水稀释20倍），PEG（聚乙二醇）400和硫酸铵等。四、操作方法1.蛋白质在两相中的分配在I0mL刻度离心试管中，用电子台秤称取（NH）2S0固体1.30g，PEG400液体2.00g，用吸管加入已稀释的糖化酶液2.00mL然后加水，直到总量为8.00g，用橡皮塞塞紧试管口，用力摇数分钟，使（NH）2S04完全溶解，并使两相充分混合，以便酶在两相中的分配达到平衡，然后，用台式离心机离心3min，转速3000r/min，分别读出上下相的体积，求相比R（上相体积与下相体积之比，R=V上/V下），并用考马斯亮蓝比色法测定两相中的蛋白质浓度，求出分配系数2.考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量标准曲线的制作方法见实验三。样品的测定方法如下：上相液：吸取上相液1.0mL，用水稀释定容到10mL，吸取1.0mL稀释液于试管中，按标准曲线相同的方法加入考马斯亮蓝溶液比色测定。下相液：吸取下相液0.5mL于试管中，加蒸馏水0.5mL，然后，按相同方法操作。根据在595nm波长下所测得的吸收值，由标准曲线线线性方程和不同的稀释倍数，计算出上下相中蛋白质浓度(mg/ml)。然后按式(2-1)求分配系数K。五、实验结果和讨论4
4 实验二 两水相系统中蛋白质分配系数的测定 一、实验目的和要求 掌握蛋白质在两水相系统中分配系数的测定方法。 二、实验原理 在两水相系统中，生物大分子物质与成相组分之间通过疏水键、氢键和离子键等相互作用而不同程度 地分配在两相中，当萃取达到平衡时，蛋白质在上、下两相中的浓度之比，称为分配系数 K，可用下式表 示： K=c1/c2 (2-1) 式中：c1——表示平衡状态下，上相蛋白质的浓度 c2——表示平衡状态下，下相蛋白质的浓度 相比：上下相体积比称为相比 R = V 上/ V 下 本实验以糖化酶为实验对象，在 PEG/(NH4)2SO4两水相系统中进行分配，糖化酶为生物大分子蛋白，是 黑曲霉经发酵制得的，糖化酶广泛用于酒、醋、味精等发酵工业中起糖化作用，能将淀粉转化为葡萄糖。 用考马斯亮兰(CBB G-250)比色法分别测定上下相中总蛋白的含量，求分配系数。 CBB G-250 是一种染料， 酸性溶液中呈棕红色，与蛋白质通过范德华键结合成蓝色复合物，595nm 波长有最大吸收值。低浓度（0.01～ 1.0mg/mL）时，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。 三、实验器材与试剂 1.器材 电于台秤，10mL 刻度离心试管，台式离心机，移液管或町调式移液器，小滴管，50 m1 容量瓶和试管 等。 2.试剂 糖化酶(2 万 U／mL 左右，使用前用水稀释 20 倍)，PEG(聚乙二醇)400 和硫酸铵等。 四、操作方法 1.蛋白质在两相中的分配 在 l0mL 刻度离心试管中，用电子台秤称取(NH4)2SO4固体 1.30g，PEG400 液体 2.00g，用吸管加入已稀 释的糖化酶液 2.00mL 然后加水，直到总量为 8.00g，用橡皮塞塞紧试管口，用力摇数分钟，使(NH4)2SO4完 全溶解，并使两相充分混合，以便酶在两相中的分配达到平衡，然后，用台式离心机离心 3min，转速 3000r ／min，分别读出上下相的体积，求相比 R(上相体积与下相体积之比，R = V 上/ V 下)，并用考马斯亮蓝比色 法测定两相中的蛋白质浓度，求出分配系数 2. 考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量 标准曲线的制作方法见实验三。样品的测定方法如下： 上相液：吸取上相液 1.0mL，用水稀释定容到 10mL，吸取 1.0mL 稀释液于试管中，按标准曲线相同 的方法加入考马斯亮蓝溶液比色测定。 下相液：吸取下相液 0.5mL 于试管中，加蒸馏水 0.5mL，然后，按相同方法操作。 根据在 595 nm 波长下所测得的吸收值，由标准曲线线线性方程和不同的稀释倍数，计算出上下相中 蛋白质浓度(mg／m1)。然后按式(2-1)求分配系数 K。 五、实验结果和讨论
1.求上、下相蛋白质浓度及分配系数K，求出相比R，计算该两相系统中PEG和（NH)SO的量。六、注意事项1.台称上称重时，应先显示零点，再将空重去皮：分配系数实验称重时，必须按顺序加入物料，中间不要再去皮，最终控制总重8.00g2.分光光度计的使用：选择波长→空白液推入光路→T模式下调0-调100%→A模式下进行样品测量-测完拿出比色血洗净，并用少量乙醇润洗3.用比色法分析上、下相蛋白质浓度时，选择正确的吸出在同一离心试管中的上、下两相操作方法：吸管小心吸出上相→将多余上相和少量下相弃去→换吸管，吸出下相。七、思考题1.配制两水相萃取系统时，PEG400液体的加量能否改为量取相应的体积?说明理由。2.在配制两水相系统时，为什么必须充分混合，混合不充分会带来什么影响？3.分析引起实验误差的因素。O
5 1. 求上、下相蛋白质浓度及分配系数 K，求出相比 R，计算该两相系统中 PEG 和 (NH4)2SO4的量。 六、注意事项 1.台称上称重时，应先显示零点，再将空重去皮； 分配系数实验称重时，必须按顺序加入物料，中间不要再去皮，最终控制总重 8.00g 2.分光光度计的使用： 选择波长→ 空白液推入光路→T 模式下调 0→调 100%→ A 模式下进行样品测量→测完拿出比色皿洗 净,并用少量乙醇润洗 3. 用比色法分析上、下相蛋白质浓度时，选择正确的吸出在同一离心试管中的上、下两相操作方法： 吸管小心吸出上相→将多余上相和少量下相弃去→换吸管，吸出下相。 七、思考题 1．配制两水相萃取系统时，PEG400 液体的加量能否改为量取相应的体积?说明理由。 2．在配制两水相系统时，为什么必须充分混合，混合不充分会带来什么影响？ 3．分析引起实验误差的因素
实验三考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量一、实验目的通过实验，熟悉和掌握考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量的实验原理和操作方法二、实验原理考马斯亮蓝G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)比色法是常用的一种蛋白质含量的测定方法。1976年由Bradfford建立，用于测定蛋白质浓度。考马斯亮蓝G-250是一种染料，在酸性溶液中为棕红色，最大光吸收波长为465nm。它能与蛋白质通过疏水作用结合，形成蛋白质一染料的复合物，颜色由红色转变为蓝色，在595nm波长下有最大吸收值，并且在低浓度范围内(0.01~1.0mg/mL)，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。该法操作简单，反应迅速，2min左右即达到平衡，而且灵敏度很高，可测微克级的蛋白质含量，所生成的染料一蛋白质颜色稳定，实验重复性好，抗干扰性也强，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。被测蛋白质与标准蛋白质氨基酸组成差异较大时，有一定误差，因为与染料结合量不同。三、实验器材与试剂1.器材精密电子天平，电子台秤，分光光度汁（可见光），恒温水浴锅，容量瓶，小试管，小滴管和移液管（或可调式移液器）等。2.试剂考马斯亮蓝G-250，牛血清蛋白（生化试剂），NaCI，95%乙醇和85%磷酸等。（1）考马斯亮蓝G-250溶液配制精确称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95%乙醇中，并加入100mL85%浓磷酸，然后，用蒸馏水稀释并定容至1000mL。（2）牛血清蛋白溶液配制称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馅水并定容至100mL，制成0.1mg/mL（100ug/mL）的溶液。或精确称取0.060g牛血清蛋白（生化试剂)，加入0.526gNaCl，溶于少量蒸馏水中，然后稀释定容至500mL，配成120ug/mL的牛血清蛋白原液。（3）待测蛋白质溶液。牛血清蛋白溶液，取5mg生血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，制成50ug/mL的溶液。或人血清，使用前用0.15mol/LNaCI稀释200倍。四、操作方法1.标准曲线制作方法在5支试管中，分别精确吸取牛血清蛋白原液0.20mL，0.40mL，0.60mL，0.80mL，1.00mL，用蒸馏水全部稀释至1.0mL，然后分别加入5.00mL考马斯亮蓝溶液，混合均匀，于(25土1)℃的恒温水浴中保温10min，冷水浴中冷却后，立即于595nm波长处比色测定（比色应在1h内完成）。以1.00ml蒸馏水代替样品液，加入5.00mL考马斯亮蓝溶液，其余操作同上，做空白对照。以试管中标准蛋白的总量(ug)为横坐标，相应的吸光度值(A)为纵坐标作标准曲线图，并作线性回归，求线性方程。6
6 实验三 考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量 一、实验目的 通过实验，熟悉和掌握考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量的实验原理和操作方法。 二、实验原理 考马斯亮蓝 G-250(Coomassie brilliant blue G-250)比色法是常用的一种蛋白质含量的测定方法。1976 年由 Bradfford 建立，用于测定蛋白质浓度。 考马斯亮蓝 G-250 是一种染料，在酸性溶液中为棕红色，最大光吸收波长为 465 nm。它能与蛋白质通 过疏水作用结合，形成蛋白质—染料的复合物，颜色由红色转变为蓝色，在 595 nm 波长下有最大吸收值， 并且在低浓度范围内(0.01~1.0mg／mL)，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。研究发现，染料主要是与蛋 白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。 该法操作简单，反应迅速，2 min 左右即达到平衡，而且灵敏度很高，可测微克级的蛋白质含量，所 生成的染料—蛋白质颜色稳定，实验重复性好，抗干扰性也强，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。这一 方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 被测蛋白质与标准蛋白质氨基酸组成差异较大时，有一定误差，因为与染料结合量不同。 三、实验器材与试剂 1. 器材 精密电子天平，电子台秤，分光光度汁(可见光)，恒温水浴锅，容量瓶，小试管，小滴管和移液管(或 可调式移液器)等。 2. 试剂 考马斯亮蓝 G-250，牛血清蛋白(生化试剂)，NaCI，95％乙醇和 85％磷酸等。 （1）考马斯亮蓝 G-250 溶液配制 精确称取 100 mg 考马斯亮蓝 G-250，溶于 50 mL 95％乙醇中，并加入 100 mL85％浓磷酸，然后，用 蒸馏水稀释并定容至 1 000 mL。 （2）牛血清蛋白溶液配制 称取 10mg 牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至 100mL，制成 0.1mg／mL（100ug/mL）的溶液。 或精确称取 0.060 g 牛血清蛋白(生化试剂)，加入 0.526g NaCl，溶于少量蒸馏水中，然后稀释定容至 500 mL，配成 120 ug／mL 的牛血清蛋白原液。 （3）待测蛋白质溶液。 牛血清蛋白溶液，取 5mg 牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至 100mL，制成 50ug／mL 的溶液。 或人血清，使用前用 0.15mol/L NaCl 稀释 200 倍。 四、操作方法 1. 标准曲线制作方法 在 5 支试管中，分别精确吸取牛血清蛋白原液 0.20 mL，0.40 mL，0.60 mL，0.80 mL，1.00 mL，用蒸 馏水全部稀释至 1.0 mL，然后分别加入 5.00 mL 考马斯亮蓝溶液，混合均匀，于(25±1)℃的恒温水浴中保 温 10min，冷水浴中冷却后，立即于 595 nm 波长处比色测定（比色应在 l h 内完成）。以 1.00m1 蒸馏水代 替样品液，加入 5.00mL 考马斯亮蓝溶液，其余操作同上，做空白对照。以试管中标准蛋白的总量(ug)为横 坐标，相应的吸光度值(A)为纵坐标作标准曲线图，并作线性回归，求线性方程
取6支试管，按下表平行操作：表1标准曲线的制作025134试管编号标准蛋白质(0.1mg/mL)0. 000.200. 400. 600. 801. 001. 000. 200. 00蒸馏水（mL）0.800. 600.405.005. 005. 005. 005. 00考马斯亮蓝试剂（mL)5.00摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色光吸收值Asgsnmo80100蛋白质含量（μg）204060绘制标准曲线：以Asgsnm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。0.5mg牛血清蛋白/mL溶液的A595约为0.50，0.05mg牛血清蛋白/mL溶液的A595约为0.29。2.牛血清样品的测定取1.00mL牛血清样品于试管中，按上述相同方法加入考马斯亮蓝溶液并比色测定。根据所测定的A595值，由标准曲线线性方程，计算出未知样品的蛋白质质量浓度（mg/mL)。表2牛血清样品的测定6试管编号1. 00样品蛋白质mL5.00考马斯亮蓝试剂（mL）摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色光吸收值Asgsnm蛋白质含量（ug）五、实验结果和讨论1.将比色分析的操作过程及结果列成表格，作标准曲线图，并作线性回归，求出线性方程。2.计算未知牛血清蛋白的含量。六、注意事项1.显色受时间和温度影响较大，标准曲线和样品测定应尽量控制在同一条件下进行。在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。2．利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。3．比色杯易受蓝色污染，应注意用乙醇清洗。不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色血，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。七、思考题用考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量，与其他测定蛋白质的方法相比，该法有何优缺点？
7 取 6 支试管，按下表平行操作： 表 1 标准曲线的制作 试管编号 0 1 2 3 4 5 标准蛋白质(0.1mg/mL) 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水（mL） 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 考马斯亮蓝试剂（mL） 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 摇匀，1h 内以 0 号管为空白对照，在 595nm 处比色 光吸收值 A595nm 蛋白质含量（μg） 0 20 40 60 80 100 绘制标准曲线：以 A595nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。0.5mg 牛血清蛋 白/mL 溶液的 A595约为 0.50，0.05mg 牛血清蛋白/mL 溶液的 A595约为 0.29。 2. 牛血清样品的测定 取 1.00 mL 牛血清样品于试管中，按上述相同方法加入考马斯亮蓝溶液并比色测定。根据所测定的 A595 值，由标准曲线线性方程，计算出未知样品的蛋白质质量浓度(mg／mL)。 表 2 牛血清样品的测定 试管编号 6 样品蛋白质 mL 1.00 考马斯亮蓝试剂（mL） 5.00 摇匀，1h 内以 0 号管为空白对照，在 595nm 处比色 光吸收值 A595nm 蛋白质含量（μg） 五、实验结果和讨论 1．将比色分析的操作过程及结果列成表格，作标准曲线图，并作线性回归，求出线性方程。 2．计算未知牛血清蛋白的含量。 六、注意事项 1．显色受时间和温度影响较大，标准曲线和样品测定应尽量控制在同一条件下进行。在试剂加入后 的 5-20min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 2．利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一 定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。测定中， 蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。 3．比色杯易受蓝色污染，应注意用乙醇清洗。 不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量 95%的乙醇荡 洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 七、思考题 用考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量，与其他测定蛋白质的方法相比，该法有何优缺点?
实验四双水相萃取α一淀粉酶的分配平衡实验一一不同PEG分子量对双水相萃取α-淀粉酶分配系数的影响一、实验目的1．掌握双水相萃取技术的基本原理和主要影响因素。2.了解自标产物的性质如等电点、电荷和分子量等。3.熟悉聚乙二醇（PEG）/硫酸铵体系双水相萃取实验操作。4.明确PEG分子量、硫酸铵浓度、pH和添加NaC1等因素对α-淀粉酶分配系数的影响。二、实验原理双水相萃取技术在萃取胞内酶中应用广泛，最常采用的双水相体系是PEG/Dex或PEG/低分子盐系统，其中低分子盐最常采用的是硫酸铵、磷酸钟和硫酸镁。3ot/goKP质量分数/%双水相系统相图PEG6000/KPPEG/磷酸钾双水相体系相图如上所示。T为上相浓度，B为下相浓度，C为系统临界点，TCB为临界线或双节线，双节线以上为两相区、以下为一相区或均相区。因此两相浓度要足够高才可以形成两相。双水相萃取分配系数K=Ci/C2，为上相和下相的浓度比。双水相系统分配系数的影响因素包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和离子强度、pH等，以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、等电点和分子量等。利用双水相技术可以获得特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配。相图中TMB为系线，其长度由相组成的总浓度决定，表征两相差异程度。在临界点附近系线长度趋近于零，表示上相和下相的组成相同，因此分配系数应为1。随着PEG、硫酸铵和盐浓度增大，系线长度增加，上相和下相相对组成的差别就增加，酶在两相中的分配系数会受到极大的影响。影响物质在双水相系统中分配的主要因素有：组成双水相体系的高聚物类型；高聚物的平均分子量和分子量分布；高聚物的浓度；成相盐和非成相盐的种类；盐的离子强度；pH值。本实验采用PEG/硫酸铵双水相体系研究α-淀粉酶的分配，具体研究PEG分子量、硫酸铵浓度、pH和添加NaC1浓度对a-淀粉酶分配系数的影响。参考：-淀粉酶是广泛应用的生物酶类，B.Subtilis细菌α-淀粉酶是研究和应用较多的α-淀粉酶，其分子量为48KD，PI约为5，最适pH5.3-6.4，在pH4.8-8.5之间稳定。三、实验器材和试剂1.实验器材：低速离心机；酸度计：漩涡混合器；分光光度计2.实验试剂：PEG：（分子量分别为2000、4000、6000、8000）、硫酸铵、α-淀粉酶、考马斯亮蓝G-2508
8 实验四 双水相萃取α-淀粉酶的分配平衡实验 ——不同 PEG 分子量对双水相萃取α-淀粉酶分配系数的影响 一、实验目的 1．掌握双水相萃取技术的基本原理和主要影响因素。 2．了解目标产物的性质如等电点、电荷和分子量等。 3．熟悉聚乙二醇（PEG）/硫酸铵体系双水相萃取实验操作。 4．明确 PEG 分子量、硫酸铵浓度、pH 和添加 NaCl 等因素对α-淀粉酶分配系数的影响。 二、实验原理 双水相萃取技术在萃取胞内酶中应用广泛，最常采用的双水相体系是 PEG/Dex 或 PEG/低分子盐系统， 其中低分子盐最常采用的是硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁。 PEG/磷酸钾双水相体系相图如上所示。T 为上相浓度，B 为下相浓度, C 为系统临界点，TCB 为临界线 或双节线，双节线以上为两相区、以下为一相区或均相区。因此两相浓度要足够高才可以形成两相。双水 相萃取分配系数 K=C1/C2，为上相和下相的浓度比。 双水相系统分配系数的影响因素包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和 离子强度、pH 等，以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、等电点和分子量等。利用双水相技术可以获得 特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配。 相图中 TMB 为系线，其长度由相组成的总浓度决定，表征两相差异程度。在临界点附近系线长度趋 近于零，表示上相和下相的组成相同，因此分配系数应为 1。随着 PEG、硫酸铵和盐浓度增大，系线长度 增加，上相和下相相对组成的差别就增加，酶在两相中的分配系数会受到极大的影响。 影响物质在双水相系统中分配的主要因素有：组成双水相体系的高聚物类型；高聚物的平均分子量 和分子量分布；高聚物的浓度；成相盐和非成相盐的种类；盐的离子强度；pH 值。 本实验采用 PEG/硫酸铵双水相体系研究α-淀粉酶的分配，具体研究 PEG 分子量、硫酸铵浓度、pH 和 添加 NaCl 浓度对α-淀粉酶分配系数的影响。 参考：-淀粉酶是广泛应用的生物酶类，B.Subtilis 细菌α-淀粉酶是研究和应用较多的α-淀粉酶，其分子量为 48 KD， PI 约为 5，最适 pH5.3-6.4，在 pH4.8-8.5 之间稳定。 三、实验器材和试剂 1. 实验器材: 低速离心机；酸度计；漩涡混合器；分光光度计 2. 实验试剂: PEG：（分子量分别为 2000、4000、6000、8000）、硫酸铵、α-淀粉酶、考马斯亮蓝 G-250