《生物化学实验技术》实验指导书
1 《生物化学实验技术》 实验指导书
目录实验一DNS（3，5-二硝基水杨酸）比色法测定还原糖.3实验二氨基酸的纸层析5实验三醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白实验四9影响酶作用的因素，实验五蛋白质的盐析沉淀和变性反应..12实验六卵磷脂的提取与鉴定..14实验七淀粉酶活性测定（3，5-二硝基水杨酸比色法）..16实验八粗脂肪的提取与检测.18
2 目 录 实验一 DNS（3，5-二硝基水杨酸）比色法测定还原糖 .3 实验二 氨基酸的纸层析.5 实验三 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白.7 实验四 影响酶作用的因素.9 实验五 蛋白质的盐析沉淀和变性反应.12 实验六 卵磷脂的提取与鉴定.14 实验七 淀粉酶活性测定（3，5-二硝基水杨酸比色法） .16 实验八 粗脂肪的提取与检测.18
实验一DNS（3.5-二硝基水杨酸）比色法测定还原糖一、实验目的掌握还原糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，燕糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3，5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基一5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。COOHCOOHIOH.OH加热+还原糖碱性O2NNH2O2NNO2三、实验材料、主要仪器和试剂1.实验材料小麦面粉；精密pH试纸。2.主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11（2）大离心管：50mL×2（3）烧杯：100mLX1（4）三角瓶：100mL×1（5）容量瓶：100mL×3（6）刻度吸管：1mL×1：2mL×2；10mL×1（7）恒温水浴锅（8）沸水浴（9）离心机（10）电子天平（11）分光光度计3.试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂称取6.5gDNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000mL容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000mL。四、操作步骤1.制作葡萄糖标准曲线取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。3
3 实验一 DNS（3,5-二硝基水杨酸）比色法测定还原糖 一、实验目的 掌握还原糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。 二、实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原 糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶 解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸 水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄 糖含量计）。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3- 氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度 计，在 540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由 于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以 0.9。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 小麦面粉；精密 pH 试纸。 2． 主要仪器 （1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11 （2）大离心管：50mL×2 （3）烧杯：100mL×1 （4）三角瓶：100mL×1 （5）容量瓶：100mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1 （7）恒温水浴锅 （8）沸水浴 （9）离心机 （10）电子天平 （11）分光光度计 3．试剂 （1）1mg/mL 葡萄糖标准液 准确称取 80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖 100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到 100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至 100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 称取 6.5g DNS 溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入 1000mL 容量瓶中，加入 2mol/L 氢氧化钠溶液 325mL，再加入 45g 丙三醇，摇匀，冷却后定容至 1000mL。 四、操作步骤 1．制作葡萄糖标准曲线 取 7 支 20mL 具塞刻度试管编号，按表 1 分别加入浓度为 1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和 3,5- 二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液
表1葡萄糖标准曲线制作蒸馏水DNS1mg/mL葡萄糖标准液葡萄糖含量光密度值管号(mL)(mL)(mL)(mg)(ODs40m)2001. 5010. 21.81. 50. 220. 41.61. 50. 430. 61. 41. 50. 640.81. 50.81. 251. 01. 01.51.061. 20. 81. 51. 2将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，用流动水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。2．样品中还原糖的测定（1）还原糖的提取准确称取0.50g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入40mL蒸馅水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到50mL离心管中，于4000r/min下离心5min，沉淀可用5mL蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在50mL容量瓶中，或将浸出液（含沉淀）过滤到50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。（2）显色和比色取2支20mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。表2样品还原糖测定DNS蒸馏水还原糖待测液光密度值查曲线葡萄糖量管号(mL)(mL)(mL)(ODs40m)(mg)70. 51. 51. 581. 51. 50.5五、结果与计算：计算出7、8号管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。提取液总体积查曲线所得葡萄糖毫数×测定时取用体积100%还原糖%)=样品毫克数六、注意事项（1）离心时对长称位置的离心管必须配平。（2）标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色七、思考题1．比色时为什么要设计空白管？2.如何正确绘制和使用标准曲线？4
4 表 1 葡萄糖标准曲线制作 管 号 1mg/mL 葡萄糖标准液 （mL） 蒸馏水 （mL） DNS （mL） 葡萄糖含量 （mg） 光密度值 （OD540nm） 0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5min，取出，用流动水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至 20mL， 加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长 540nm，用 0 号管调零点，测出 1~6 号管的光密 度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。 2．样品中还原糖的测定 （1）还原糖的提取 准确称取 0.50g 食用面粉，放入 100mL 烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入 40mL 蒸馏水， 搅匀，置于 50℃恒温水浴中保温 20min，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到 50mL 离心管中， 于 4 000r/min 下离心 5min，沉淀可用 5mL 蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在 50mL 容量瓶中，或将浸出液（含沉淀）过滤到 50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待 测液。 （2）显色和比色 取 2 支 20mL 具塞刻度试管，编号，按表 2 所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标 准曲线的 0 号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。 表 2 样品还原糖测定 管 号 还原糖待测液 （mL） 蒸馏水 （mL） DNS （mL） 光密度值 （OD540nm） 查曲线葡萄糖量 （mg） 7 0.5 1.5 1.5 8 0.5 1.5 1.5 五、结果与计算： 计算出 7、8 号管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算 出样品中还原糖和总糖的百分含量。 % 100% 样品毫克数 测定时取用体积 提取液总体积 查曲线所得葡萄糖毫克数 还原糖（ ） 六、注意事项 （1）离心时对长称位置的离心管必须配平。 （2）标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色 七、思考题 1．比色时为什么要设计空白管？ 2．如何正确绘制和使用标准曲线？
实验二氨基酸的纸层析一、实验目的1.了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。2.学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的操作技术。二、实验原理用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法，它是分配层析法的一种。纸层析所用的展层溶剂大多是由水饱和的有机溶剂组成。滤纸纤维的一OH基的亲水性基团，可吸附有机溶剂中的水作为固定相，有机溶剂作为流动相，它沿滤纸自下向上移动，称为上行层析：反之，使有机溶剂自上而下移动，称为下行层析。将样品点在滤纸上进行展层，样品中的各种氨基酸即在二相中不断进行分配，由于它们各自的分配系数不同，故在流动相中移动速率不等，从而使不同的氨基酸得到分离和提纯氨基酸经层析在滤纸上形成距原点不等的层析点，氨基酸在滤纸上的移动速率用Rf表示。Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离只要实验条件（如温度、展层溶剂的组分、pH、滤纸的质量等）不变，Rf值是常数，因此可做定性分析参考。由于氨基酸无色，可利用三酮反应使氨基酸层析点显色，从而定性和定量。三、仪器和试剂1.仪器层析滤纸、烧杯、剪刀、层析缸、培养皿、喷雾器、毛细管、吹风机、直尺、铅笔等。2.试剂（1）混合氨基酸溶液（水解后的氨基酸干粉）甘氨酸溶液：25mg甘氨酸溶于5mL水中。蛋氨酸溶液：25mg蛋氨酸溶于5mL水中。亮氨酸溶液：25mg亮氨酸溶于5mL水中。氨基酸混合液：甘氨酸25mg，亮氨酸25mg，蛋氨酸25mg共溶于5mL水中。（2）展层溶剂正丁醇：冰乙酸：水=4：1：3（V/V)，充分振荡，静置分层后，放出下层水层，取上层溶液备用。（3）显色贮备液：0.1%水合三酮正丁醇溶液。四、实验步骤1.画基线戴上指套或橡皮手套，在长约15cm、宽约14cm滤纸上，距短边2cm处，用铅笔画一条线，即为基线。2.点样在原线上，从距纸的长边4cm处开始，每隔3cm用毛细管依次分别点上甘氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和混合氨基酸溶液。点样点干后可重复点加1～2次。每一点的直径不超过3mm。3.展层将点好样的滤纸卷成筒形，滤纸两边不相接触，用线固定好，将原线的下端浸入盛有溶剂的培养皿中，立即展层。基线必须保持在液面之上，以免氨基酸与溶剂直接接触。盖好层析缸，当溶剂前沿距纸端3cm时，取出滤纸，记下溶剂前沿位置。4.显色滤纸取出后，吹干，均匀喷涂水合三酮显色液，静置1-2min，电吹风吹干即出现紫红色的氨基5
5 实验二 氨基酸的纸层析 一、实验目的 1.了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 2.学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的操作技术。 二、实验原理 用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法，它是分配层析法的一种。纸层析所用的展层溶 剂大多是由水饱和的有机溶剂组成。滤纸纤维的—OH 基的亲水性基团，可吸附有机溶剂中的水作为固 定相，有机溶剂作为流动相，它沿滤纸自下向上移动，称为上行层析；反之，使有机溶剂自上而下移 动，称为下行层析。将样品点在滤纸上进行展层，样品中的各种氨基酸即在二相中不断进行分配，由 于它们各自的分配系数不同，故在流动相中移动速率不等，从而使不同的氨基酸得到分离和提纯。 氨基酸经层析在滤纸上形成距原点不等的层析点，氨基酸在滤纸上的移动速率用 Rf 表示。Rf = 原 点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 只要实验条件(如温度、展层溶剂的组分、pH、滤纸的质量等)不变，Rf 值是常数，因此可做定性 分析参考。由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析点显色，从而定性和定量。 三、仪器和试剂 1．仪器 层析滤纸、烧杯、剪刀、层析缸、培养皿、喷雾器、毛细管、吹风机、直尺、铅笔等。 2．试剂 （1）混合氨基酸溶液(水解后的氨基酸干粉) 甘氨酸溶液：25mg 甘氨酸溶于 5mL 水中。 蛋氨酸溶液：25mg 蛋氨酸溶于 5mL 水中。 亮氨酸溶液：25mg 亮氨酸溶于 5mL 水中。 氨基酸混合液： 甘氨酸 25mg，亮氨酸 25mg，蛋氨酸 25mg 共溶于 5mL 水中。 （2）展层溶剂 正丁醇∶冰乙酸∶水 = 4∶1∶3(V/V)，充分振荡，静置分层后，放出下层水层，取上层溶液备用。 （3）显色贮备液： 0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。 四、实验步骤 1.画基线 戴上指套或橡皮手套，在长约 15cm、宽约 14cm 滤纸上，距短边 2 cm 处，用铅笔画一条线，即 为基线。 2.点样 在原线上，从距纸的长边 4cm 处开始，每隔 3cm 用毛细管依次分别点上甘氨酸、亮氨酸、蛋氨酸 和混合氨基酸溶液。点样点干后可重复点加 1～2 次。每一点的直径不超过 3mm。 3.展层 将点好样的滤纸卷成筒形，滤纸两边不相接触，用线固定好，将原线的下端浸入盛有溶剂的培养 皿中，立即展层。基线必须保持在液面之上，以免氨基酸与溶剂直接接触。盖好层析缸，当溶剂前沿 距纸端 3cm 时，取出滤纸，记下溶剂前沿位置。 4.显色 滤纸取出后，吹干，均匀喷涂水合茚三酮显色液，静置 1-2min，电吹风吹干即出现紫红色的氨基
酸层析斑点。用铅笔划下层析斑点，可进行定性、定量测定。五、结果与计算用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的R值。Rf（迁移率）=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。六、注意事项1.点样时要避免手指或睡液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的部分）。2.点样斑点不能太大（直径应小于0.3cm），防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。3.展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。七、思考题1.详述氨基酸纸层析的原理和用途6
6 酸层析斑点。用铅笔划下层析斑点，可进行定性、定量测定。 五、结果与计算 用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到 溶剂前沿的距离，计算各色斑的 Rf值。 Rf（迁移率）= 原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。 六、注意事项 1．点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的部分）。 2．点样斑点不能太大（直径应小于 0.3 cm），防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且吹风 温度不宜过高，否则斑点变黄。 3．展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。 七、思考题 1．详述氨基酸纸层析的原理和用途
实验三醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白一、实验目的1.掌握醋酸薄膜电泳技术分离蛋白质的基本原理2.学会电泳的一般操作注意：点样量对于电泳分辨率有影响；电泳过程稳压电源控制和恒定：透明前的处理。3.解释蛋白电泳的结果与分析二、实验原理采用醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素，是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚度约为120微米。醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术，它具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点。该技术已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结构球蛋白、同功酶的分离和测定等方面。目前，醋酸纤维素薄膜电泳趋向于代替纸电泳。三、实验仪器与实验用品1.仪器及其它用品（1）醋酸纤维素薄膜—2cm×8cm（2）培养皿（直径910cm）（3）毛细管（4）直尺和铅笔（5）镊子（6）电泳仪和电泳槽（7）普通滤纸（8）染色缸2.实验材料：未溶血的人或动物血清3.试剂(1)新鲜血清——无溶血现象。(2)巴比妥-巴比妥钠缓冲溶液（PH8.6，0.07mo1/L，离子强度0.06）：称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600mL，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000mL。置4℃保存，备用。(3)染色液：称取氨基黑10B0.5克，加入蒸馏水40毫升，甲醇50毫升和冰乙酸10毫升，混匀，在具塞试剂瓶中贮存。4）漂洗液：取95%乙醇45毫升，冰乙酸5毫升和蒸留水50毫升。混匀，在具塞试剂瓶内贮存。(5)透明液：甲液一一取冰乙酸15毫升和无水乙醇85毫升，混勾，装入试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。乙液一一取冰乙酸25毫升和无水乙醇75毫升，混匀，装入试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。四、实验步骤（一）仪器和薄膜的准备1.醋酸纤维素薄膜的润湿和选择：取2cm×8cm的薄膜，手无光泽面一端1.5cm处用铅笔轻轻地划一直线，然后将薄膜小心放入盛有缓冲溶液的培养皿内，使它漂浮在液面。若迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则表明薄膜质地均匀；若润湿时，薄膜上出现深浅不一致的条纹或斑点等，则为不均匀的薄膜。实验中应选用质地均匀的薄膜。因为纤维素薄膜的质量对电泳的结果影响很大。例如，膜厚薄不匀可以造成区带歪扭不齐、各区带界限不清、背景脱色困难、实验结果难于重复等现象。将选用的薄膜用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（30分钟左右）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光泽面。2.制作“滤纸桥”：剪裁尺寸合适的滤纸条。取双层附看在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。然后，用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧7
7 实验三 醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白 一、实验目的 1.掌握醋酸薄膜电泳技术分离蛋白质的基本原理 2.学会电泳的一般操作 注意：点样量对于电泳分辨率有影响；电泳过程稳压电源控制和恒定；透明前的处理。 3.解释蛋白电泳的结果与分析 二、实验原理 采用醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素，是纤维素的 羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后， 涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚度约为 120 微米。 醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术，它具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品 无拖尾和吸附现象等优点。该技术已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结构球蛋白、 同功酶的分离和测定等方面。目前，醋酸纤维素薄膜电泳趋向于代替纸电泳。 三、实验仪器与实验用品 1.仪器及其它用品 （1）醋酸纤维素薄膜——2cm×8cm （2）培养皿（直径 9—10cm） （3）毛细管 （4）直尺和铅笔 （5）镊子 （6）电泳仪和电泳槽 （7）普通滤纸 （8）染色缸 2.实验材料： 未溶血的人或动物血清 3.试剂 (1)新鲜血清——无溶血现象。 (2)巴比妥-巴比妥钠缓冲溶液（PH8.6，0.07mol/L，离子强度 0.06）： 称取 1.66g 巴比妥（AR）和 12.76g 巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约 600mL，稍 加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至 1000mL。置 4℃保存，备用。 (3)染色液： 称取氨基黑 10B 0.5 克，加入蒸馏水 40 毫升，甲醇 50 毫升和冰乙酸 10 毫升，混匀，在具塞 试剂瓶中贮存。 (4)漂洗液：取 95%乙醇 45 毫升，冰乙酸 5 毫升和蒸馏水 50 毫升。混匀，在具塞试剂瓶内贮存。 (5)透明液： 甲液——取冰乙酸 15 毫升和无水乙醇 85 毫升，混匀，装入试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 乙液——取冰乙酸 25 毫升和无水乙醇 75 毫升，混匀，装入试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 四、实验步骤 （一）仪器和薄膜的准备 1. 醋酸纤维素薄膜的润湿和选择：取 2cm×8cm 的薄膜，于无光泽面一端 1.5cm 处用铅笔轻轻地 划一直线，然后将薄膜小心放入盛有缓冲溶液的培养皿内，使它漂浮在液面。若迅速润湿，整条薄膜 色泽深浅一致，则表明薄膜质地均匀；若润湿时，薄膜上出现深浅不一致的条纹或斑点等，则为不均 匀的薄膜。实验中应选用质地均匀的薄膜。因为纤维素薄膜的质量对电泳的结果影响很大。例如，膜 厚薄不匀可以造成区带歪扭不齐、各区带界限不清、背景脱色困难、实验结果难于重复等现象。 将选用的薄膜用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（30 分钟左右）后取出，夹在 清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光泽面。 2.制作“滤纸桥”：剪裁尺寸合适的滤纸条。取双层附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的 前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。然后，用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧
贴在支架上，即为“滤纸桥”。按照同样的方法，在另一个电极槽的支架上制作相同的“滤纸桥”。它们的作用是联系醋酸纤维素薄膜和两极缓冲液之间的中间“桥梁”。3.平衡：用平衡装置（或自制的平衡管），使两个电极槽内缓冲液的液面彼此处于水平的状态。一般需要平衡15一20分钟。注意，平衡后应将平衡装置的活塞关好（或除去平衡管）。（二）点样在薄膜无光泽的一面点样。点样时，先用玻璃栽玻片蘸取血清，点加在原划好线的1.5厘米处（见图1）。注意，切不可用力过大把薄膜弄破。事先可在滤纸上练习点样，掌握点样技术，这是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。（三）电泳将已点样的薄膜使无光泽面向下贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上（见图2），点样端靠近负极。平衡10分钟，仔细检查电泳装置的线路是否正确，然后通电。打开电源开关，调节电压和电流强度，先旋动仪器粗调旋钮，再旋动细调旋钮。调节到薄膜每厘米宽的电流强度为0.3毫安，通电10一15分钟后，再将电压和电流强度提高到薄膜每厘米长度电压为15伏左右，薄膜每厘米宽的电流强度为0.4一0.6毫安。在电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，防止过高或偏低。待电泳区带展开约3.5厘米时，则关闭电源，一般通电时间为50分钟左右。4Scm醋酸纤维素薄膜滤纸桥滤纸桥TA(+)电极槽支架土物点祥区.h1.50mE图2酷酸纤维密荐脑电泳装置示密图图雕股纤维杂海旗规格及点样位置（四）染色电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5分钟。然后，用漂洗液浸洗，隔5分钟左右换一次漂洗液，连续更换三次，可使背景颜色脱去。将膜夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。操作中，要注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。（五）结果判断一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白、α，球蛋白、α，球蛋白、β球蛋白和y球蛋白。(六)透明将染色后漂洗干净的薄膜用吹风机吹干，再浸入透明液的甲液中，浸泡2min后立即浸入透明液的乙液中，浸泡1min（要准确），然后迅速取出薄膜，将它紧贴在玻璃板上，不要存留气泡。大约2～3min内的薄膜完全透明，放置10～15min后，用吹风机将膜吹干。用单面刀片从膜的一角撬起，向下用力平推，可以容易地从玻璃板上取下透明的薄膜。这样就做成了色泽鲜艳而又透明的血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱。五、实验结果和讨论1.将实验结果列入表格，并作图。六、思考题1：电泳中，血清样品点在支持介质的哪一端？为代么？2.引起电泳图谱不整齐的原因是什么？8
8 贴在支架上，即为“滤纸桥”。按照同样的方法，在另一个电极槽的支架上制作相同的“滤纸桥”。它 们的作用是联系醋酸纤维素薄膜和两极缓冲液之间的中间“桥梁”。 3.平衡：用平衡装置（或自制的平衡管），使两个电极槽内缓冲液的液面彼此处于水平的状态。一 般需要平衡 15—20 分钟。注意，平衡后应将平衡装置的活塞关好（或除去平衡管）。 （二）点样 在薄膜无光泽的一面点样。点样时，先用玻璃栽玻片蘸取血清，点加在原划好线的 1.5 厘米处（见 图 1）。注意，切不可用力过大把薄膜弄破。事先可在滤纸上练习点样，掌握点样技术，这是获得具有 清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。 （三）电泳 将已点样的薄膜 使无光泽面向下贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上（见图 2），点样端靠近负极。 平衡 10 分钟，仔细检查电泳装置的线路是否正确，然后通电。打开电源开关，调节电压和电流强度， 先旋动仪器粗调旋钮，再旋动细调旋钮。调节到薄膜每厘米宽的电流强度为 0.3 毫安，通电 10—15 分 钟后，再将电压和电流强度提高到薄膜每厘米长度电压为 15 伏左右，薄膜每厘米宽的电流强度为 0.4 —0.6 毫安。在电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，防止过高或偏低。待电泳区带展开约 3.5 厘 米时，则关闭电源，一般通电时间为 50 分钟左右。 （四）染色 电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色 5 分钟。然后，用漂洗液浸洗，隔 5 分钟左右 换一次漂洗液，连续更换三次，可使背景颜色脱去。将膜夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。操作 中，要注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。 （五）结果判断 一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白、α1 球蛋白、α2 球 蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。 (六)透明 将染色后漂洗干净的薄膜用吹风机吹干，再浸入透明液的甲液中，浸泡 2min 后立即浸入透明液的 乙液中，浸泡 1min（要准确），然后迅速取出薄膜，将它紧贴在玻璃板上，不要存留气泡。大约 2～3min 内的薄膜完全透明，放置 10～15min 后，用吹风机将膜吹干。用单面刀片从膜的一角撬起，向下用力 平推，可以容易地从玻璃板上取下透明的薄膜。这样就做成了色泽鲜艳而又透明的血清蛋白醋酸纤维 薄膜电泳图谱。 五、实验结果和讨论 1．将实验结果列入表格，并作图。 六、思考题 ⒈ 电泳中，血清样品点在支持介质的哪一端？为什么？ ⒉ 引起电泳图谱不整齐的原因是什么？
实验四影响酶作用的因素（温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响）一、实验目的1.了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。2.学习检定温度、pH、激活剂、抑制剂影响酶促反应速度的方法。二、实验原理在酶促反应中，酶的催化活性与环境温度、pH有密切关系，通常各种酶只有在一定的温度、pH范围内才表现它的活性，一种酶表现其活性最高时的温度、pH值称为该酶的最适温度、最适pH。在酶促反应中，酶的激活剂和抑制剂可加速或抑制酶的活性，如氯化钠在低浓度时为睡液淀粉酶的激活剂，而硫酸铜则是它的抑制剂。本实验利用淀粉水解过程中不同阶段的产物与碘有不同的颜色反应，定性观察睡液淀粉酶在酶促反应中各种因素对其活性的影响。淀粉（遇碘呈蓝色）→紫色糊精（遇碘呈紫色）→红色糊精（遇碘呈红色）→无色糊精（遇碘不呈色）一→麦芽糖（遇碘不呈色）一葡萄糖（遇碘不呈色）。所以淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断，以此反映淀粉酶的活性，由此检定温度、pH、激活剂、抑制剂对酶促反应的影响。三、实验仪器与实验用品1.实验器材试管和试管架、恒温水浴、冰浴、吸量管（1mL6支、2mL4支、5mL4支）、滴管、量筒、玻棒、白瓷板、秒表、烧杯、棕色瓶。2.实验试剂（1）新鲜唾液稀释液（唾液淀粉酶液）：每位同学进实验室自己制备，先用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水约15mL，并作咀嚼咕漱运动，3min后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内，过滤于小烧杯中备用，此称制备睡唾液。取制备睡液于量筒并稀释20倍（稀释倍数可因人而异），混匀备用。（2）1%淀粉溶液A（含0.3%NaC1)：将1g可溶性淀粉及0.3g氯化钠混悬于5mL蒸馏水中，搅动后，缓慢倒入沸腾的60mL蒸馏水中，搅动煮沸1min，冷却至室温，加水至100mL，置冰箱中保存。（3）1%淀粉溶液B（不含NaC1)（4）碘液：称取2g碘化钾溶于5mL蒸馏水中，再加入1g碘，待碘完全溶解后，加蒸馏水95mL，混匀贮于棕色瓶中。（5）1%NaC1溶液（6）1%CuSO,溶液（7）缓冲溶液系统按下表混合配制。pH0.2mo1/L磷酸氢二钠溶液体积/mL0.1mo1/L柠檬酸溶液体积/mL5.05.154. 855.86.053. 956.87.722. 288.09.720. 28柠檬酸（C6H807·H20）相对分子质量210.14，0.1mo1/L溶液为21.01g/L。Na2HP04相对分子质量=141.98；0.2mo1/L溶液为28.04g/L。Na2HP04·2H20相对分子质量=178.05；0.2mo1/L溶液为35.61g/L。Na2HP04·12H20相对分子质量=358.22：0.2mo1/L溶液为71.64g/L。四、操作步骤1.温度对酶促反应的影响9
9 实验四 影响酶作用的因素 （温度、pH 及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响） 一、实验目的 1．了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。 2．学习检定温度、pH、激活剂、抑制剂影响酶促反应速度的方法。 二、实验原理 在酶促反应中，酶的催化活性与环境温度、 pH 有密切关系，通常各种酶只有在一定的温度、pH 范围内才表现它的活性，一种酶表现其活性最高时的温度、pH 值称为该酶的最适温度、最适 pH。 在酶促反应中，酶的激活剂和抑制剂可加速或抑制酶的活性，如氯化钠在低浓度时为唾液淀粉酶 的激活剂，而硫酸铜则是它的抑制剂。 本实验利用淀粉水解过程中不同阶段的产物与碘有不同的颜色反应，定性观察唾液淀粉酶在酶促 反应中各种因素对其活性的影响。 淀粉（遇碘呈蓝色）→紫色糊精(遇碘呈紫色)→红色糊精(遇碘呈红色)→无色糊精 (遇碘不呈色)→麦芽糖(遇碘不呈色)→葡萄糖(遇碘不呈色)。 所以淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断，以此反映淀粉酶的 活性，由此检定温度、pH、激活剂、抑制剂对酶促反应的影响。 三、实验仪器与实验用品 1.实验器材 试管和试管架、恒温水浴、冰浴、吸量管（1 mL6 支、2 mL4 支、5 mL 4 支）、滴管、量筒、 玻棒、白瓷板、秒表、烧杯、棕色瓶。 2.实验试剂 （1）新鲜唾液稀释液(唾液淀粉酶液)：每位同学进实验室自己制备，先用蒸馏水漱口，以清除 食物残渣，再含一口蒸馏水约 15mL，并作咀嚼咕漱运动，3 min 后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱 布的漏斗内，过滤于小烧杯中备用，此称制备唾液。取制备唾液于量筒并稀释 20 倍(稀释倍数可因人 而异)，混匀备用。 （2）1%淀粉溶液 A(含 0.3%NaCl)：将 1 g 可溶性淀粉及 0.3 g 氯化钠混悬于 5 mL 蒸馏水中，搅 动后，缓慢倒入沸腾的 60 mL 蒸馏水中，搅动煮沸 1 min，冷却至室温，加水至 100 mL,置冰箱中保 存。 （3）1%淀粉溶液 B(不含 NaCl) （4）碘液：称取 2 g 碘化钾溶于 5 mL 蒸馏水中，再加入 1 g 碘，待碘完全溶解后，加蒸馏水 95 mL，混匀贮于棕色瓶中。 （5）1%NaCl 溶液 （6）1%CuSO4溶液 （7）缓冲溶液系统按下表混合配制。 pH 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液体积/ mL 0.1 mol/L 柠檬酸溶液体积/ mL 5.0 5.8 6.8 8.0 5.15 6.05 7.72 9.72 4.85 3.95 2.28 0.28 柠檬酸（C6H8O7·H20）相对分子质量 210.14，0.1 mol/L 溶液为 21.01g/L。 Na2HPO4 相对分子质量=141.98； 0.2 mol/L 溶液为 28.04g/L。 Na2HPO4·2H20 相对分子质量=178.05； 0.2 mol/L 溶液为 35.61g/L。 Na2HPO4·12H20 相对分子质量=358.22； 0.2 mol/L 溶液为 71.64g/L。 四、操作步骤 1．温度对酶促反应的影响
取3支试管编号，按下表进行操作：试管号淀粉酶液酶液处理温度/pH6.8缓冲溶1%淀粉溶液反应温度/观察结果体积/mLC,5min液体积/mLA体积/mLC, 10 min020111212137~4037~40312170左右70左右上述各管在不同的温度下保温反应10min后，立即取出，流水冷却3min，向各管分别加入碘液1滴。仔细观察各试管溶液的颜色并记录，说明温度对酶活性的影响，确定最适温度。2.pH对酶促反应的影响取1支试管，加入1%淀粉溶液（A）2mL、pH6.8缓冲溶液3mL、淀粉酶液2mL，摇匀后，向试管内插入一支玻棒，置37℃水浴保温。每隔1min用玻棒从试管中取出1滴混合液于白瓷板上，随即加入碘液1滴，检查淀粉水解程度。待混合液遇碘不变色时，从水浴中取出试管，立即加入碘液1滴摇匀后，观察溶液的颜色，再次确认水解程度。记录从加入酶液到加入碘液的时间，此时间称为保温时间。若保温时间太短（2～3min），说明酶液活力太高，应酌情稀释酶液；若保温时间太长（15min以上），说明酶液活力太低，应酌情减少稀释倍数，保温时间最好在8～15min。然后进行如下操作：取4支试管编号，按下表操作：试管号缓冲溶液体积/mL淀粉酶液体积/mL1%淀粉溶液A观察（每隔1min逐管结果体积/mLpH 8.0pH 5. 0pH5.8pH 6.8加入）1023002232200030030220034022将上述各管溶液混匀后，再以1min间隔依次将4支试管置于37℃水浴中保温。达保温时间后，依次将各管迅速取出，并立即加入碘液1滴。观察各试管溶液的颜色并记录。分析pH对酶促反应的影响，确定最适pH。3.激活剂、抑制剂对酶促反应的影响取3支试管编号，按下表加入各试剂（体积单位：mL）：试管号蒸馏水观察结果1%淀粉溶液B1%NaC1溶液1%CuSO溶液淀粉酶液210011220101320011将上述各管溶液混匀后，向1号试管内插入一支玻棒，3支试管同置于37℃水浴保温1min左右，用玻棒从1号试管中取出1滴混合液，检查淀粉水解程度（方法同步骤2）。待混合液遇碘液不变色时，从水浴中迅速取出3支试管，各加碘液1滴。摇匀观察各试管溶液的颜色并记录，分析酶的激活和抑制情况。五、实验结果和讨论1.将实验结果列入表格，并写实验报告。六、注意事项1.加入酶液后，要充分摇匀，保证酶液与全部淀粉液接触反应，得到理想的颜色梯度变化。2.用玻棒取液前，应将试管内溶液充分混匀，取出试液后，立即放回试管中一起保温。七、思考题1.什么是酶的最适温度、最适pH？它们是酶的特征物理常数吗？10
10 取 3 支试管编号，按下表进行操作： 试管号 淀粉酶液 体积/ mL 酶液处理温度/ ℃，5 min pH6.8 缓冲溶 液体积/ mL 1%淀粉溶液 A 体积/ mL 反应温度/ ℃，10 min 观察结果 1 2 3 1 1 1 0 37～40 70 左右 2 2 2 1 1 1 0 37～40 70 左右 上述各管在不同的温度下保温反应 10 min 后，立即取出，流水冷却 3 min， 向各管分别加入碘 液 1 滴。仔细观察各试管溶液的颜色并记录，说明温度对酶活性的影响，确定最适温度。 2．pH 对酶促反应的影响 取 1 支试管,加入 1%淀粉溶液(A)2 mL、pH6.8 缓冲溶液 3 mL、淀粉酶液 2 mL，摇匀后，向试管 内插入一支玻棒,置 37 ℃水浴保温。每隔 1 min 用玻棒从试管中取出 1 滴混合液于白瓷板上，随即加 入碘液 1 滴，检查淀粉水解程度。待混合液遇碘不变色时，从水浴中取出试管，立即加入碘液 1 滴， 摇匀后，观察溶液的颜色，再次确认水解程度。记录从加入酶液到加入碘液的时间，此时间称为保温 时间。若保温时间太短（2～3 min），说明酶液活力太高，应酌情稀释酶液；若保温时间太长（15 min 以上），说明酶液活力太低，应酌情减少稀释倍数，保温时间最好在 8～15 min。然后进行如下操作： 取 4 支试管编号，按下表操作： 试管号 缓冲溶液体积/ mL 1%淀粉溶液 A 体积/ mL 淀粉酶液体积/ mL （每隔 1 min 逐管 加入） 观察 结果 pH 5.0 pH5.8 pH 6.8 pH 8.0 1 2 3 4 3 0 0 0 0 3 0 0 0 0 3 0 0 0 0 3 2 2 2 2 2 2 2 2 将上述各管溶液混匀后，再以 1 min 间隔依次将 4 支试管置于 37 ℃水浴中保温。达保温时间后， 依次将各管迅速取出，并立即加入碘液 1 滴。观察各试管溶液的颜色并记录。分析 pH 对酶促反应的 影响，确定最适 pH。 3．激活剂、抑制剂对酶促反应的影响 取 3 支试管编号，按下表加入各试剂（体积单位：mL）： 试管号 1%淀粉溶液 B 1%NaCl 溶液 1%CuSO4溶液 蒸馏水 淀粉酶液 观察结果 1 2 3 2 2 2 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 将上述各管溶液混匀后，向 1 号试管内插入一支玻棒，3 支试管同置于 37 ℃水浴保温 1 min 左 右，用玻棒从 1 号试管中取出 1 滴混合液，检查淀粉水解程度(方法同步骤 2)。待混合液遇碘液不变 色时，从水浴中迅速取出 3 支试管，各加碘液 1 滴。摇匀观察各试管溶液的颜色并记录，分析酶的激 活和抑制情况。 五、实验结果和讨论 1．将实验结果列入表格，并写实验报告。 六、注意事项 1．加入酶液后，要充分摇匀，保证酶液与全部淀粉液接触反应，得到理想的颜色梯度变化。 2．用玻棒取液前，应将试管内溶液充分混匀，取出试液后，立即放回试管中一起保温。 七、思考题 1．什么是酶的最适温度、最适 pH？它们是酶的特征物理常数吗？