核酸的制备及基因组文库的构建 朱德裕
朱德裕 核酸的制备及基因组文库的构建
主要内容 、核酸制备的基本原理 二、核酸制备的基本方法 三、质粒DNA的制备 四、基因组DNA的制备 五、RNA的制备 六、基因组、cDNA文库的构建
一、核酸制备的基本原理 二、核酸制备的基本方法 三、质粒DNA的制备 四、基因组DNA的制备 五、RNA的制备 六、基因组、cDNA文库的构建 主要内容
、核酸制备的基本原理 DNA主要存于细胞核中,其它如线粒体和质体等, 也含有少量DNA。 RNA主要存于细胞质中,其它如线粒体和核仁等也 含有RNA 在生物体中,DNA和RNA都一般以核蛋白的形式存 在。 核酸不溶于一般有机溶剂
一、核酸制备的基本原理 DNA主要存于细胞核中，其它如线粒体和质体等， 也含有少量DNA。 RNA主要存于细胞质中，其它如线粒体和核仁等也 含有RNA。 在生物体中，DNA和RNA都一般以核蛋白的形式存 在。 核酸不溶于一般有机溶剂
原核细胞与真核细胞 Eukaryote DNA Prokaryote DNA organized in a single Nucleus chromosome No nucleus. No mitosis DNA organized in multiple chromosomes inside a nucleus Mitotic division 类别 原核细胞 真核细胞 细胞大小 较小 较大 无成形的细胞核,有成形的真正的细 细胞核无核膜,无核仁,胞核,有核膜、核 无染色体 仁和染色体 有核糖体、线粒体 有核糖体 等,植物细胞还有 细胞质(唯一的细胞器)叶绿体和液泡等 (有多种细胞器) 生物类群细菌、蓝藻、放线菌植物、动物、真菌
原核细胞与真核细胞
原核细胞简示图 细菌的基本构造 菌毛 细胞质 原核细胞的主要结构有细胞膜、 细胞质、核糖体,以及由一条裸 露的DNA双链所构成的拟核。拟 拟核 核没有与细胞质部分相隔开的界 膜(核膜),这是与真核细胞的 荚膜 主要区别。 细胞壁 细胞膜 真核细胞中只有植物细胞有细胞 壁 核糖体 鞭毛 原核细胞中的DNA没有组蛋白 histone)与之结合。无有丝分裂( mitosis和减数分裂 ( meiosis,DNA复制后,细胞随即分裂为二
菌毛 原核细胞简示图 原核细胞的主要结构有细胞膜、 细胞质、核糖体，以及由一条裸 露的 DNA 双链所构成的拟核。拟 核没有与细胞质部分相隔开的界 膜（核膜），这是与真核细胞的 主要区别。 真核细胞中只有植物细胞有细胞 壁。 原核细胞中的DNA没有组蛋白(histone)与之结合。无有丝分裂(mitosis)和减数分裂 (meiosis),DNA复制后，细胞随即分裂为二。 拟核 核糖体
真核细胞简示图 细胞膜 内质网 真核细胞含有细胞核。 核糖体 DNA与组蛋白等蛋白质 细胞质 共同组成染色体结构, 细胞核 体在核内可看到核仁。真 中心粒 核生物进行有性繁殖, 并进行有丝分裂。也有 些真核生物的细胞也能 囊泡 细胞膜暂时 形成的折叠 进行无丝分裂,如人的 肝脏细胞。 尔基体
真核细胞简示图 真核细胞含有细胞核 。 DNA与组蛋白等蛋白质 共同组成染色体结构， 在核内可看到核仁。真 核生物进行有性繁殖， 并进行有丝分裂。也有 些真核生物的细胞也能 进行无丝分裂，如人的 肝脏细胞
核酸制备的基本原理 1、细胞破碎 2、将核蛋白解联,即利用解联剂将核蛋白裂 解为核酸和蛋白。 精致纯化核酸 注意事项:操作过程应避免核酸的降解,包括 化学因素(如过酸过碱),物理因素(如强烈 振荡、高温、辐射等),生物酶等
核酸制备的基本原理 1、细胞破碎 2、将核蛋白解联，即利用解联剂将核蛋白裂 解为核酸和蛋白。 3、精致纯化核酸 注意事项：操作过程应避免核酸的降解，包括 化学因素（如过酸过碱），物理因素（如强烈 振荡、高温、辐射等），生物酶等
二、核酸制备的基本方法 (一)细胞破碎 1、物理方法 机械碾碎:对于动物组织(如鼠肝),一般多采用匀 浆的方法。 组织捣碎器:是一种剧烈的破碎的方法,必须保持低温 ,时间不宜太长 超声波:借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的 有效方法。 压榨法:是一种温和、彻底破碎细胞的方法。即用高压 迫使几十毫升细胞悬液通过一个小于细胞直径的小孔, 使细胞被挤压破碎
二、核酸制备的基本方法 （一） 细胞破碎 1、 物理方法 机械碾碎： 对于动物组织（如鼠肝），一般多采用匀 浆的方法。 组织捣碎器：是一种剧烈的破碎的方法，必须保持低温 ，时间不宜太长。 超声波： 借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的 有效方法。 压榨法：是一种温和、彻底破碎细胞的方法。即用高压 迫使几十毫升细胞悬液通过一个小于细胞直径的小孔， 使细胞被挤压破碎
2、溶胀和自溶 溶胀:在低渗溶液(如低浓度的稀盐溶液中),由于存在渗透 压差,溶剂分子将大量进入细胞,致使细胞膜膨胀破裂 自溶:细胞结构在本身所具有的各种水解酶作用下,发生溶 解。应用此法要特别小心,防止目的核酸被分解。 3、化学处理 用脂溶性的溶剂(如丙酮、氯仿、甲苯等)或表明活性剂( SDS)处理细胞时,可使细胞壁和细胞膜的结构部分溶解,导 致细胞破碎。 4、生物酶降解 如溶菌酶等生物酶有降解细胞壁的功能。在用此法处理细菌细 胞时,先是细胞壁消融,然后是渗透压引起的细胞膜破裂,导 致细胞破碎
2、 溶胀和自溶 溶胀：在低渗溶液（如低浓度的稀盐溶液中），由于存在渗透 压差，溶剂分子将大量进入细胞，致使细胞膜膨胀破裂。 自溶： 细胞结构在本身所具有的各种水解酶作用下，发生溶 解。应用此法要特别小心，防止目的核酸被分解。 3、化学处理 用脂溶性的溶剂（如丙酮、氯仿、甲苯等）或表明活性剂（ SDS）处理细胞时，可使细胞壁和细胞膜的结构部分溶解，导 致细胞破碎。 4、生物酶降解 如溶菌酶等生物酶有降解细胞壁的功能。在用此法处理细菌细 胞时，先是细胞壁消融，然后是渗透压引起的细胞膜破裂，导 致细胞破碎
各种组织细胞破碎方法 细胞破碎方法应用 1匀浆法 机体软组织 2捣碎法 动物韧性组织 3研磨法 细菌、酵母 4超声法 细胞混悬液 5反复冻融法 培养细胞 6冷热交替法 细菌、病毒 7高压破碎 细菌、细胞 8有机溶剂 细菌、酵母 9去垢剂 组织、培养细胞 10酶解法 细菌、酵母
各种组织细胞破碎方法 细胞破碎方法 应用 1匀浆法 机体软组织 2捣碎法 动物韧性组织 3研磨法 细菌、酵母 4超声法 细胞混悬液 5反复冻融法 培养细胞 6冷热交替法 细菌、病毒 7高压破碎 细菌、细胞 8有机溶剂 细菌、酵母 9去垢剂 组织、培养细胞 10酶解法 细菌、酵母