@奉山年单花 省级精品课程申报 生物化学与分子生物学实验指导 前言 21世纪是生命科学的世纪，生物化学与分子生物学是当代生命科学领域中 门重要的基础学科，它涵盖的基础理论，基本知识，基本技术与医学研究各学 科领域密切相关，其理论与技术的发展，推动了生命科学的发展，对人类的科技 进步与文明产生巨大影响。生物化学实验是医学院校学生必修的一门基础实验 技术课程，其研究技术的发展与应用是依据物理学、化学及生物学的基本理论 和实验方法而建立起来的。20世纪20年代微量分析的发展，30年代电子显微 镜的出现，40年代层析技术和电泳技术的兴起，以及同位素示踪技术、各种光 谱技术、核磁共振技术的应用，激光、超导等新技术的出现，电子计算机技术 的突飞猛进，使生物化学实验手段提高到一个崭新的水平，掌握生物化学实验 方法和研究技术，对医学院校学生来说是十分重要的。 本门课程主要侧重于给学生以基本的实验方法和技能的训练，让学生了解并 掌握生物化学的四大基本实验方法，即：分光光度法、离心法、层析法和电泳 法。同时也注意引进一些新近发展起来的、重要的生物化学及分子生物学研究 技术，作为学生学习其他专业课程和进入科学研究领域的准备。 本教材是在多版泰山医学院生物化学教研室自编教材的基础上，结合教学实 践和近年来最新进展编写而成。在教材的出版过程中得到张念华老师的帮助， 在此对为教材作出贡献的老教师和张念华老师表示衷心的感谢。 由于编者水平有限，教材中可能有一些错误和不足，望同行专家和使用者提 出宝贵意见。 编者 2008.10
M 泰山医学院 Taishan Medical University 省级精品课程申报 目录 第一章生物化学实验基本知识与操作··5 第一节生物化学实验基本知识···.5 5 第二节 8 第二章分光光度技术···20 实验一双缩脲法测定蛋白质浓度···.32 实验二 Folin-酚试剂法(Lowry 法)测定蛋白质浓度·····.··.··34 实验三紫外分光光度法测定蛋白质浓度···36 实验四考马斯(Comessie)亮兰结合法测定蛋白质浓度···.38 实验五BCA 法测定蛋白质浓度··.. 41 实验六激素对血糖浓度的影响及血糖的测定43 第三章生物大分子的提取、沉淀和离心分离技术.50 第一节生物材料的选取与预处理····.50 第二节生物大分子的沉淀分离技术·.55 第三节生物大分子离心分离技术·58 实验七鸡血SOD的提取、分离及活力测定6 65 实验八碱性磷酸酶的制备及活力测定 68 实验九酪蛋白的制备····.··.·· 72 实验十动物肝脏中提取DNA. 74 实验十一猪心肌细胞线粒体可溶性ATP合酶的提··.·· 77 第四章电泳技术·······.····.·· 82 实验十二DNA 琼脂糖凝胶电泳···.. 90 实验十三血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳·.94 实验十四聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶.·..98 实验十五蛋白质分子量的测定——SDS-聚丙烯凝胶电泳··.··.···105
M 泰山医学院 Taishan Medical University 省级精品课程申报 实验十六聚丙烯酰胺等电聚焦电泳·.·108 第五章层析技术···113 第一节 层析技术概述 ·····.········.··.···113 第二节 吸附层析 ········.·······.··.·.·.·..·.·.·115 115 第三节 分配层析 117 第四节 离子交换层析 119 第五节 凝胶层析 122 第六节亲和层析·········..·126 第七节 高效液相层析 127 实验十七氨基酸的纸上层析与氨基酸的转氨基作用···.··.··129 实验十八血清-球蛋白的分离纯化与鉴定..132 实验十九 亲和层析纯化胰蛋白酶···.········.··.···137 实验十二离子交换层析分离氨基酸·141 实验二十一蛋白质分子量测定——凝胶过滤层析法·······144 第六章 分子生物学基本技术···.······.··.···1 148 第一节 核酸分子杂交·······.·······.··.··· 148 第二节 聚合酶链反应····.. 152 第三节分子克隆···············.·.·· 156 实验二十二Southern 杂交分析·.··········.··.····· 160 实验二十三 Northern 杂交分析· 163 实验二十四 PCR 基因扩增·····.·······.··.···· 166 验二十五质粒DNA的提取及酶切.169 实验二十六 DNA重组实验 171 实验二十七大肠杆菌感受态细胞的制备及转化···172 附录一常用缓冲液的配制方法······..·· 173
泰山医学院 Taishan Medical University 省级精品课程申报 附录二易变质及需要特殊方法保存的试剂····.··.···184 附录三一般化学试剂的分级····.186 附录四 English words in the lab ··.······.··.··187 参考资料··.··········.····.... 190
@本山年华花 省级精品课程申报 第一章生物化学实验基本知识与操作 第一节生物化学实验基本知识 一、实验课目的与要求 (一)实验课目的 1.加深对生物化学基本理论的理解和掌握。 2.掌握生物化学的基本实验方法和实验技术。 3.培养学生严谨的科学态度和思维能力以及独立分析问题和解决问题的能 力。 (二)实验课要求 1.实验前必须预习实验指导和有关理论，明确实验月的、原理、预期的结 果，操作关键步骤及注意事项。 2.实验时要严肃认真专心进行操作，注意观察实验过程中出现的现象和结 果，结果不良时，必须重做。 3.实验中，应及时将实验结果如实记录下来，并请老师当场审核。根据实 验结果进行科学分析，按时将实验报告交教师评阅。 二、实验室规则 1,严肃、认真、积极、主动地上好实验课。进实验室时要穿戴好隔离衣， 不得穿拖鞋、背心出入实验室，以免酸碱腐蚀皮肤。 2.进实验室前准备好实验指导、课本、笔记、实验记录本、报告本、文具 3.要保持实验台整洁，试剂、仪器应整齐，按次序放置。实验完毕要按各 类仪器的清洗方法和要求将仪器清洗干净。 4.实验室是培养学生独立思考、独立工作能力及良好科学作风的重要场所， 操作务必认真不得敷衍，室内应保持肃静，不得吸烟、玩闹，不得随地吐痰， 乱丢纸屑。实验后要清扫实验台面、地面、试剂瓶要码放整齐。 5.要爱护仪器、节约药品。第一次实验时要按仪器清单清点仪器，负责保 管，用后如数交还，在使用时如有破损，及时报告，经指导教师检查后填写破损 单，按学校规定赔偿。 6.贵重仪器，如分光光度计、离心机等，要尽力爱护，使用前应熟悉使用
@春山单花 省级精品课程申报 方法，严格遵守操作规程，严禁随意开动。 7.要节约水电，一经用完随手关闭水门、电门。 三、值日生任务 1.领发本次所用仪器、物品，清点、交还临时用仪器、物品，若有损坏负 责追查赔偿。 2.管理操作公用仪器，打蒸馏水。 3.搞好实验室卫生，做到仪器、桌面、地面、水池…全干净。 4.确保安全：管好仪器、门窗、水电。 5.请任课及实验室老师检查工作，认可后方能离开实验室。 四、试剂使用规则 1.使用试剂前应仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需要。 2.取出试剂后，立即将瓶塞盖好，切勿盖错，放回原处。试剂瓶塞、专用 吸量管、滴管，不得与试剂瓶分家，以兔错用而污染试剂，造成自己或他人实 验的失败。未用完的试剂不得倒回瓶内。昂贵的Sephadex、Sepharose凝胶和 DEAE纤维素等，用后必须及时回收，不得丢弃。 3.使用滴管时，滴管尖端朝下，切勿倒置，勿使试剂流入橡皮帽内。 4.使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒量取，若用吸管时只能用吸 耳球吸取，切勿用嘴吸取，以兔造成意外。 五、废弃物处理 1.所有固体废弃物如：用过的滤纸、棉花、碎屑沉淀物和电泳后的凝胶等 必须倾弃于垃圾筒中。 2.浓酸必须弃于小钵中，用水稀释后倒入水池中。 六、安全注意事项 1,低沸点有机溶剂，如乙醚、石油醚、酒精等均系易燃物品，使用时应禁 明火、远离火源，若需加热要用水浴加热，不可直接在火上加热。 2.若发生酸碱灼伤事故，先用大量自来水清洗，酸灼伤者用饱和NaHC0溶 液中和，碱灼伤者用饱和HB0溶液中和，氧化剂伤害者用NaS0:处理。 3.若发生起火事件，根据发生起火性质分别采用砂、水、C02或CC1:灭火器
⑧来山压学花 省级精品课程申报 扑灭。 4,离开实验室必须关好窗户，切断电源、水源，以确保安全。 七、实验室意外事故的处理 实验室如遇着火、烫伤、割伤等意外事件发生，必须镇静，作紧急处理， 并立即报告教员，作如下处理： 1、着火：如洒精灯推倒或其他原因起火，首先将一切易燃物品移至安全处， 然后将火扑灭。灭火方法：可用湿布或工作服盖上扑灭，或盖上一层沙扑灭。 如乙醚、油类等比水轻易燃的物品着火时，切勿用水，火势大时速取灭火器灭 之。 2、火伤：皮肤被火灼伤，用烫伤软膏涂之，如伤势较重，即送医院。 3、药品伤：皮肤被药品所侵蚀，应据药品的性质加以适当处理后，用单宁油 膏或凡士林涂之，如是酸或碱，则先用大量水冲洗，然后用5%的小苏打液或1% 醋酸分别处理。 如眼晴为药品所侵入，用水洗去后，继以5%的小苏打液或1%的硼酸液冲洗， 视侵入药品的性质而定。必要时，去医院处理。 4、割伤出血：凡遇到玻璃割伤出血，可用碘酒或红药水消毒后（切忌碘酒与 红药水同时应用)，用纱布包扎。如有玻璃留在伤口，应先取出再作处理。 5、毒物入口：有毒之物切勿用吸管直接用口吸取。如遇毒物入口，除酸、碱 外，应先使之呕吐，用芥子粉或0.06克吐酒石溶于2毫升水中作致吐剂，温盐 水肥皂水也可用。如是腐蚀性物质，则饮以鸡蛋清作润滑剂
@表山年花 es 省级精品课程申报 第二节生物化学实验基本操作 一、玻璃仪器的清洁及使用 (一)玻璃仪器的清洁 1.玻璃仪器的清洗 实验中所用的玻璃仪器清洁与否，直接影响实验的结果，往往由于仪器的 不清洁或被污染而造成较大的实验误差，有时甚至会导致实验的失败。做生物 化学实验对玻璃仪器清洁程度的要求，比一般化学实验的要求更高。这是因为： ①生物化学实验中蛋白质、酶、核酸等往往都是以“毫克”和“微克”计的， 稍有杂质，影响就很大。②生物化学实验对许多常见的污染杂质十分敏感，如 金属离子（钙、镁离子等）、去污剂和有机物残基等，因此玻璃仪器（包括离 心管等塑料器皿)是否彻底清洗净就是非常重要的。 ()新购玻璃仪器的清洗 新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用0.5%的去污剂洗 刷，再用自来水洗净，然后浸泡在1%一2%盐酸溶液中过夜（不可少于四小时）， 再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在100℃一120℃烘箱内烘干备用。 (②)使用过的玻璃仪器的清洗 一般非计量玻璃仪器或粗容量仪器：如试管、烧杯、量筒等普通玻璃仪器 可直接用毛刷蘸餐洗净刷洗，然后用自来水冲洗，直至容器内不挂水珠即可。 最后用少量蒸馏水冲洗内壁2一3次，倒置晾干即可。 容量分析仪器：容量瓶、滴定管及吸管等容量仪器，用后用自来水多次冲洗， 如能清洁（壁不挂水珠），再用蒸馏水少量冲洗23次晾干即可备用。若仍不干 净附有油污等，则须于干后放入铬酸洗液内浸泡数小时，然后倒净（或捞出） 洗液，用自来水充分冲洗至水不显黄色后再冲几次，最后用少量蒸馏水冲洗23 次晾干备用。 (3)比色皿的清洗 决不可用强碱清洗，因为强碱会浸蚀抛光的比色皿。只能用洗液或1%~一2 %的去污剂浸泡，然后用自来水冲洗，这时使用一支绸布包裹的小棒或棉花球 棒刷洗，效果会更好，清洗干净的比色皿也应内外壁不挂水珠。切忌用刷子、 粗糙的布或滤纸等擦试。洗净后，倒置晾干备用
国泰山华花 省级精品课程申报 2.塑料器皿的清洗 聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化学实验中已用的越来越多。 第一次使用塑料器皿时，可先用8mol/几尿素（用浓盐酸调pl=1)清洗，接着 依次用无离子水、1mo1/LK0H和无离子水清洗，然后用10一3mol/LDTA除 去金属离子的污染，最后用无离子水彻底清洗，以后每次使用时，可只用0.5 %的去污剂清洗，然后用自来水和无离子水洗净即可。 3.洗液的配制 因己确定铬有致癌作用，因此配制和使用洗液时要极为小心，常用两种配 制方法如下： ()取100L工业浓硫酸置于烧杯内，小心加热，然后慢慢加入5g重铬酸 钾粉末，边加边搅拌，待全部溶解并缓慢冷却后，贮存在磨口玻璃塞的细口瓶 内。 (2)称取5g重铭酸钾粉末，置于250mL烧杯中，加5ml.水使其溶解，然后 慢慢加入100mL浓硫酸，溶液温度将达80℃，待其冷却后贮存于磨口玻璃瓶内 4.其他洗涤液 ()工业浓盐酸：可洗去水垢或某些无机盐沉淀。 (2)5%草酸溶液：用数滴硫酸酸化，可洗去高锰酸钾的痕迹。 (3)5%~10%磷酸三钠(Na3P0412H20)溶液：可洗涤油污物。 (4)30%硝酸溶液：洗涤二氧化碳测定仪及微量滴管。 (⑤)5%一10%乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)溶液：加热煮沸可洗脱玻璃仪 器内壁的白色沉淀物。 (6)尿素洗涤液：为蛋白质的良好溶剂，适用于洗涤盛过蛋白质制剂及血样 的容器。 (⑦)有机溶剂：如丙酮、乙醚、乙醇等可用于洗脱油脂、脂溶性染料污痕等 二甲苯可洗脱油漆的污垢。 (8)氢氧化钾的乙醇溶液和含有高锰酸钾的氢氧化钠溶液：这是两种强碱性 的洗涤液，对玻璃仪器的侵蚀性很强，可清除容器内壁污垢，洗涤时间不宜过 长，使用时应小心慎重。 5.玻璃和塑料器皿的干燥： 生化实验中用到的玻璃和塑料器皿经常需要干燥，一般地说洗净后的玻璃仪
国秦花 省级精品课程申报 器，如不急用应倒放在晾架上令其自然干燥。若有急用可放在烘烤箱中110℃一 120℃烤干，但容量玻璃仪器，如容量瓶、吸量管、滴定管以及烧结、结构复杂 的玻璃仪器等，严禁烘烤。此类仪器，如急用可采用水泵抽气法干燥。硝酸纤 维素的塑料离心管加热时会发生爆炸，所以决不能放在烘箱中干燥，只能用冷 风吹干。 (二)常用玻璃仪器的使用 1、吸量管 吸量管是生化实验最常用的仪器之一，测定的准确度和吸量管的正确选择和使 用有密切关系。常用的吸量管可以分为三类： (①)刻度吸量管刻度吸量管是多刻度吸量管，供量取10mL以下任意体积的 溶液，有0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0毫升等规格。吸量管刻度所标 的数字有自上而下和自下而上两种，使用之前应仔细分辨。有“快”字则为快 流式，有“吹”字则为吹出式，无“吹”字的吸管不可将管尖的残留液吹出。 吸、放溶液前要用吸水纸擦拭管尖。 (2)移液管常用来量取50mL、25mL、10mL、5mL、2mL、1mL的液体，这种 吸量管只有一个刻度，放液时，量取的液体自然流出后，管尖需在盛器内壁停 留15秒钟，注意管尖残留液体不要吹出。 (③)奥氏吸量管在量取粘度较大的液体如血液、血清等时，应当使用奥氏 吸管。这种吸管也是单标的，并且在其下端有一个膨大部分。所以液体与吸管 表面接触面积较小，当量取血液时，较他种吸管准确。奥氏吸管的容量包括遗 留在尖端的液体，故在缓缓使液体流出后，再停留数秒钟，吹出最后一滴。在 学生实验中常用的有0.5、1.0、2.0、3.0ml等规格