植物保护学报 Journal of plant protection,2019,46(1):208-215 DOl:10.13802/ cnki. zwbhxb20192017189 复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防效果测定 及拮抗菌株鉴定 赵璐刘胜胡同乐王亚南王树桐曹克强 (河北农业大学植物保护学院,保定071001) 摘要:为探究复合微生物菌剂对芊果再植病害的生防效果,以莘果砧木实生海棠幼苗为试材,通过 盆栽试验测试了木美土里复合微生物菌剂对苹果再植病害的防治效果及对再植海棠的促生作用, 然后对该菌剂的可分离微生物进行了分离纯化,并以尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum菌株HS2为 靶标菌,测试分离获得的10株菌株的拮抗效果,并对拮抗效果显著的1株真菌菌株和2株细菌菌株 进行种类鉴定。结果表明,木美土里复合微生物菌剂对苹果再植病害的防治效果达87.78%;经该 菌剂处理后,再植海棠苗的株高、茎粗、鲜重、干重及叶面积分别是对照处理的1.51、2.00、5.74、5.21和 2.83倍,表明该菌剂有显著的促生作用。木美土里复合微生物菌剂对菌株HS2的抑制率达到 6859%,并从中分离到7株真菌菌株,3株细菌菌株。其中,拮抗效果髙于8000%的真菌菌株有1株, 细菌菌株有2株。经鉴定,真菌菌株MMIL-1为哈茨木霉 Trichoderma har=iawm;细菌菌株BM-0l 和BM-03均为解淀粉芽胞杆菌 Bacillus amyloliquefaciens 关键词:复合微生物菌剂;苹果再植病害;生物防治;哈茨木霉;解淀粉芽胞杄菌 Determination for control effect of microbial manure against apple replant disease and the identification of antagonistic strain against Fusarium oxysporum Zhao Lu Liu Sheng Hu Tongle Wang Yanan Wang Shutong Cao Keqiang ( College of Plant Protection, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, Hebei Province, China) Abstract: To study the bio-control effect of compound microbial against apple replant disease, pot ex riments were applied to evaluate the control effect of Kimidori microbial manure(KMM) against the apple replant diseases(ARD) and whether promoting plant growth of Malus seedlings. Ten microorgan- ism strains isolated from KMM were tested in vitro for their antagonistic activity against Fusarium oxys porum, one of them was the inducing factor of ARD. The species with better inhibition rate were identi- fied through morphology and molecular biology methods. The results showed that the control effect of KMM against ARD could reach 87.78%. Seedling growth was significantly promoted by KMM treat ment. The plant height, stem diameter, fresh weight, dry weight and leaf area of KMM treatment in- creased 1.51, 2.00, 5.74, 5.21 and 2.83 times compare with that of the replant control. The inhibition rate of KMM against F oxysporum HS2 was 68.59%. Seven fungal isolates and three bacterial strains were isolated from KMM. Among these isolates, one fungal isolate MMTL-l with the inhibition rate over 80. 00% was identified as Trichoderma harzianum. Both the two bacterial isolates BM-0l and BM-03 with the inhibition rate over 80.00% were identified as Bacillus amyloliquefacier Key words: microbial manure, apple replant diseases; biological control; Trichoderma harzianum, Ba- yloliquefaciens 基金项目:国家重点研发计划(2016YFD0201100),河北省自然科学基金(c2016204140),国家现代农业(苹果)产业技术体系(CARS-27) *通信作者(Authorsforcorrespondence),E-mail:bdstwanga163com,ckq@heba.edu.cn 收稿日期:2017-09-25
植物保护学报 Journal of Plant Protection，2019，46（1）：208-215 DOI：10.13802/j.cnki.zwbhxb.2019.2017189 复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防效果测定 及拮抗菌株鉴定 赵 璐 刘 胜 胡同乐 王亚南 王树桐* 曹克强* （河北农业大学植物保护学院，保定 071001） 摘要：为探究复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防效果，以苹果砧木实生海棠幼苗为试材，通过 盆栽试验测试了木美土里复合微生物菌剂对苹果再植病害的防治效果及对再植海棠的促生作用， 然后对该菌剂的可分离微生物进行了分离纯化，并以尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum菌株HS2为 靶标菌，测试分离获得的10株菌株的拮抗效果，并对拮抗效果显著的1株真菌菌株和2株细菌菌株 进行种类鉴定。结果表明，木美土里复合微生物菌剂对苹果再植病害的防治效果达87.78%；经该 菌剂处理后，再植海棠苗的株高、茎粗、鲜重、干重及叶面积分别是对照处理的1.51、2.00、5.74、5.21和 2.83 倍，表明该菌剂有显著的促生作用。木美土里复合微生物菌剂对菌株 HS2 的抑制率达到 68.59%，并从中分离到7株真菌菌株，3株细菌菌株。其中，拮抗效果高于80.00%的真菌菌株有1株， 细菌菌株有2株。经鉴定，真菌菌株MMTL-1为哈茨木霉Trichoderma harzianum；细菌菌株BM-01 和BM-03均为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens。 关键词：复合微生物菌剂；苹果再植病害；生物防治；哈茨木霉；解淀粉芽胞杆菌 Determination for control effect of microbial manure against apple replant disease and the identification of antagonistic strain against Fusarium oxysporum Zhao Lu Liu Sheng Hu Tongle Wang Yanan Wang Shutong* Cao Keqiang* （College of Plant Protection, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, Hebei Province, China） Abstract: To study the bio-control effect of compound microbial against apple replant disease, pot experiments were applied to evaluate the control effect of Kimidori microbial manure (KMM) against the apple replant diseases (ARD) and whether promoting plant growth of Malus seedlings. Ten microorganism strains isolated from KMM were tested in vitro for their antagonistic activity against Fusarium oxysporum, one of them was the inducing factor of ARD. The species with better inhibition rate were identified through morphology and molecular biology methods. The results showed that the control effect of KMM against ARD could reach 87.78%. Seedling growth was significantly promoted by KMM treatment. The plant height, stem diameter, fresh weight, dry weight and leaf area of KMM treatment increased 1.51, 2.00, 5.74, 5.21 and 2.83 times compare with that of the replant control. The inhibition rate of KMM against F. oxysporum HS2 was 68.59%. Seven fungal isolates and three bacterial strains were isolated from KMM. Among these isolates, one fungal isolate MMTL-1 with the inhibition rate over 80.00% was identified as Trichoderma harzianum. Both the two bacterial isolates BM-01 and BM-03 with the inhibition rate over 80.00% were identified as Bacillus amyloliquefaciens. Key words: microbial manure; apple replant diseases; biological control; Trichoderma harzianum; Bacillus amyloliquefaciens 基金项目：国家重点研发计划（2016YFD0201100），河北省自然科学基金（c2016204140），国家现代农业（苹果）产业技术体系（CARS-27） * 通信作者（Authors for correspondence），E-mail：bdstwang@163.com，ckq@hebau.edu.cn 收稿日期：2017-09-25
1期 赵璐等:复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防效果测定及拮抗菌株鉴定 我国是全球最大的苹果种植国,自1992年产量 木美土里复合微生物菌剂( Kimidori microbial 超过美国之后,一直排名世界第一,种植面积和产量 manure,KMM)是一种复合型微生物生物肥料。该 占世界苹果种植面积和产量的一半以上(刘婧,微生物菌剂在对苹果锈果病及腐烂病的防控中均表 2009;赵玉山,2014)。但我国苹果的品种和树龄结现出较好的效果(李丙智等,2013;胡清玉等,2015)。 构却并不合理,富士品种¨一家独大”,而树龄在20年但该菌剂是否能够控制苹果再植病害还缺乏系统研 以上的果园占总种植面积的60%以上(姜远茂和葛究,且该菌剂的原始菌种从国外引进,其种类组成并 顺峰,2016)。因此,近年来,我国已经开始对苹果种不明确,作用机理也缺乏报道。本课题组自2012年 植结构和品种结构进行调整,导致苹果园种植模式开始在田间测试了木美土里复合微生物菌剂对苹果 更新加快和品种更新周期缩短,受制于可耕作土地再植病害的防治效果,获得了显著的防治效果(未发 的限制,苹果再植病害已经成为生产上的重要问题。表)。因此,本研究通过盆栽试验、室内对峙及拮抗 在世界范围内,一般认为多种真菌如柱孢菌 Cylin-菌株分离鉴定,在可控条件下研究木美土里复合微 drocarpon spp.、丝核菌 Rhizoctonia spp.镰孢菌F-生物菌剂对苹果再植病害的防治效果,并明确该菌 sanlu spp、茎点霉 Phoma spp.和几种卵菌如腐霉剂中的拮抗菌株,以期为进一步研究复合微生物菌 Pythium spp.和恶疫霉 Phytophthora cactorum单独剂的防病机理奠定基础。 侵染或者复合侵染均能引起苹果再植病害( Braun 99 Mazzola,1998)。邹庆甲等(2014)对分离自河1材料与方法 北省不同地区苹果再植土壤中的21株病原真菌进1.1材料 行了鉴定,明确了镰孢菌属真菌是引起河北省苹果 供试植物和菌株:八棱海棠 Malus robusta re- 再植病害的主要致病菌,其中,尖孢镰刀菌 F oxys- hd.种子购自河北省怀来县好运八棱海棠苗木基地, 分离频率最高,致病力最强 温室条件下,在蛭石:营养土为1:1的培养基中培养 虽然土壤熏蒸剂如溴甲烷、氯化苦、棉隆等都是至4叶期;苹果再植病害主要致病菌——尖孢镰刀 控制苹果再植病害的有效药剂,但其高毒性以及对菌菌株HS2由河北农业大学植物病害流行与综合 环境的毒害导致这些化学熏蒸剂日益受到抵制,其防治实验室分离鉴定并保存(邹庆甲等,2014)。 中溴甲烷已经在世界范围内被禁用。利用生物制剂 供试肥料和药剂:木美土里复合微生物菌剂,陕 替代化学熏蒸剂防治再植病害已经得到了越来越多西枫丹百丽生物科技有限公司,其中有效活菌数≥ 的关注( Kandula et al.,2010)。日前,一些能拮抗病20亿个/g;99.99%恶霉灵( hymexazol)原药,威海韩 原真菌的菌株已被发现并用于防治苹果再植病害,孚生化药业有限公司。 如细菌中的芽胞杆菌 Bacillus spp、假单胞菌Psev 培养基:马铃薯葡萄糖琼脂( potato dextrose lomonas spp,真菌中的木霉 Trichoderma、丛枝菌根agar,PDA)培养基:马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂 真菌以及放线菌中的链霉菌 Streptomyce等(Mani-粉15g、水1000mL;马丁氏培养基: KH PO41g、 ci et al,20l5; Forge et al,206)。 Biro et al.(1998)MgSO4HO0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂15g 发现枯草芽胞杆菌B. subtilis及聚团肠杆菌 Entero-蒸馏水1000mL,此培养基1000mL加人1%孟加拉 bacter agglomerans可用来防治苹果再植病害,减轻红水溶液3.3mL,使用前临时加入1%链霉素0.03mL 某些再植病害的症状; Caska& Hudska(1993)通过牛肉膏蛋白胨( beef peptone dextrose agar,BPDA)培 温室盆栽试验发现,根部接种放射形土壤杆菌Ago-养基:牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15g、 bacterium radiobacter可以减少苹果幼树的死亡,促蒸馏水1000mL;玉米粉( corn meal agar,CMA)培 进幼树生长;刘力伟等(2016)研究发现,荧光假单胞养基:玉米粉200g、琼脂20g、蒸馏水1000mL(程 菌 Pseudomonas fluorescens菌株SS101对不同苹果丽娟和薛泉宏,2012)。 产区病原菌具有抑制作用,该菌株不但可以显著缓 试剂及仪器:真菌基因组抽提试剂盒,北京全式 解再植病害的影响,而且具有促进生长和增产的效金生物技术有限公司;细菌基因组抽提试剂盒,生工 果。综合来看,目前关于苹果再植病害的生物防治生物工程(上海)股份有限公司;10× Loading buffer、 大多停留在利用单一菌株进行防治的层面上,而且 Ex Taq,日本 TaKaRa公司;其余试剂均为国产分析 这些测试菌株绝大多数尚未获得商业化应用,还缺纯。JA1003型电子分析天平,上海精密科学仪器有 乏利用已商品化的生物菌剂防治该病害的报道。限公司;DYY4型稳压稳流电泳仪,北京六一仪器
1期 赵 璐等：复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防效果测定及拮抗菌株鉴定 209 我国是全球最大的苹果种植国，自1992年产量 超过美国之后，一直排名世界第一，种植面积和产量 占世界苹果种植面积和产量的一半以上（刘婧， 2009；赵玉山，2014）。但我国苹果的品种和树龄结 构却并不合理，富士品种“一家独大”，而树龄在20年 以上的果园占总种植面积的60%以上（姜远茂和葛 顺峰，2016）。因此，近年来，我国已经开始对苹果种 植结构和品种结构进行调整，导致苹果园种植模式 更新加快和品种更新周期缩短，受制于可耕作土地 的限制，苹果再植病害已经成为生产上的重要问题。 在世界范围内，一般认为多种真菌如柱孢菌 Cylindrocarpon spp.、丝核菌 Rhizoctonia spp.、镰孢菌 Fusarium spp.、茎点霉 Phoma spp. 和几种卵菌如腐霉 Pythium spp. 和恶疫霉 Phytophthora cactorum 单独 侵染或者复合侵染均能引起苹果再植病害（Braun， 1995；Mazzola，1998）。邹庆甲等（2014）对分离自河 北省不同地区苹果再植土壤中的21株病原真菌进 行了鉴定，明确了镰孢菌属真菌是引起河北省苹果 再植病害的主要致病菌，其中，尖孢镰刀菌F. oxysporum分离频率最高，致病力最强。 虽然土壤熏蒸剂如溴甲烷、氯化苦、棉隆等都是 控制苹果再植病害的有效药剂，但其高毒性以及对 环境的毒害导致这些化学熏蒸剂日益受到抵制，其 中溴甲烷已经在世界范围内被禁用。利用生物制剂 替代化学熏蒸剂防治再植病害已经得到了越来越多 的关注（Kandula et al.，2010）。目前，一些能拮抗病 原真菌的菌株已被发现并用于防治苹果再植病害， 如细菌中的芽胞杆菌 Bacillus spp.、假单胞菌 Pseudomonas spp.，真菌中的木霉Trichoderma、丛枝菌根 真菌以及放线菌中的链霉菌Streptomyces等（Manici et al.，2015；Forge et al.，2016）。Biro et al.（1998） 发现枯草芽胞杆菌B. subtilis及聚团肠杆菌Enterobacter agglomerans可用来防治苹果再植病害，减轻 某些再植病害的症状；Catska & Hudska（1993）通过 温室盆栽试验发现，根部接种放射形土壤杆菌Agrobacterium radiobacter可以减少苹果幼树的死亡，促 进幼树生长；刘力伟等（2016）研究发现，荧光假单胞 菌 Pseudomonas fluorescens 菌株 SS101 对不同苹果 产区病原菌具有抑制作用，该菌株不但可以显著缓 解再植病害的影响，而且具有促进生长和增产的效 果。综合来看，目前关于苹果再植病害的生物防治 大多停留在利用单一菌株进行防治的层面上，而且 这些测试菌株绝大多数尚未获得商业化应用，还缺 乏利用已商品化的生物菌剂防治该病害的报道。 木美土里复合微生物菌剂（Kimidori microbial manure，KMM）是一种复合型微生物生物肥料。该 微生物菌剂在对苹果锈果病及腐烂病的防控中均表 现出较好的效果（李丙智等，2013；胡清玉等，2015）。 但该菌剂是否能够控制苹果再植病害还缺乏系统研 究，且该菌剂的原始菌种从国外引进，其种类组成并 不明确，作用机理也缺乏报道。本课题组自2012年 开始在田间测试了木美土里复合微生物菌剂对苹果 再植病害的防治效果，获得了显著的防治效果（未发 表）。因此，本研究通过盆栽试验、室内对峙及拮抗 菌株分离鉴定，在可控条件下研究木美土里复合微 生物菌剂对苹果再植病害的防治效果，并明确该菌 剂中的拮抗菌株，以期为进一步研究复合微生物菌 剂的防病机理奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 供试植物和菌株：八棱海棠 Malus robusta Rehd.种子购自河北省怀来县好运八棱海棠苗木基地， 温室条件下，在蛭石∶营养土为1∶1的培养基中培养 至4叶期；苹果再植病害主要致病菌——尖孢镰刀 菌菌株 HS2 由河北农业大学植物病害流行与综合 防治实验室分离鉴定并保存（邹庆甲等，2014）。 供试肥料和药剂：木美土里复合微生物菌剂，陕 西枫丹百丽生物科技有限公司，其中有效活菌数≥ 2.0亿个/g；99.99%恶霉灵（hymexazol）原药，威海韩 孚生化药业有限公司。 培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂 粉 15 g、水 1 000 mL；马丁氏培养基：KH2PO4 1 g、 MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、琼脂15 g、 蒸馏水1 000 mL，此培养基1 000 mL加入1%孟加拉 红水溶液3.3 mL，使用前临时加入1%链霉素0.03 mL； 牛肉膏蛋白胨（beef peptone dextrose agar，BPDA）培 养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂15 g、 蒸馏水 1 000 mL；玉米粉（corn meal agar，CMA）培 养基：玉米粉200 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL（程 丽娟和薛泉宏，2012）。 试剂及仪器：真菌基因组抽提试剂盒，北京全式 金生物技术有限公司；细菌基因组抽提试剂盒，生工 生物工程（上海）股份有限公司；10×Loading Buffer、 Ex Taq，日本TaKaRa公司；其余试剂均为国产分析 纯。JA1003型电子分析天平，上海精密科学仪器有 限公司；DYY-4型稳压稳流电泳仪，北京六一仪器
210 植物保护学报 46卷 厂;RXZ型智能人工气候箱,宁波江南仪器厂。 有9mL灭菌水的小烧杯中,制成稀释倍数为10-的 1.2方法 稀释液,如此依次稀释到10。取103、10-4、105和 1.2.1KMM对苹果再植病害的生防效果测定 10°这4个梯度的稀释液各20μ分别涂布到马丁 尖孢镰刀菌菌株HS2在PDA培养基上扩繁后氏平板和BPDA平板上,每个稀释度3次重复。将 在菌落边缘打取3个直径为6mm的菌饼接种到马丁氏平板和BPDA平板分别置于25℃和37℃恒 CMA培养基上并于25℃培养,待菌丝长满基质时温培养箱中黑暗培养。 取出,放到通风橱中风干后备用。挑选长势一致的 真菌的纯化:挑取马丁氏平板培养10d左右的 海棠幼苗,按质量比1%接种病原菌尖孢镰刀菌菌真菌菌落尖端菌丝,接种到新的马丁氏平板上,待长 株HS2,每处理3次重复,每次重复9棵幼苗。接种岀单菌落后通过反复多次挑取尖端菌丝,进行纯化 1周后分别用KKM和恶霉灵进行处理。KMM处理培养,直到得到纯的单菌落。细菌的纯化:将在BP 方法为按质量比5%的用量施到口径16cmx高14cmDA平板培养7d左右的细菌菌落进行多次划线培 的花盆中,然后浇水1000mL;恶霉灵原药按照说养,获得单菌落。将纯化后的菌株进行编号,并于 明书稀释4000倍后取1000mL均匀浇灌于花盆中4℃保存备用 作为化学对照,以仅浇水1000mL作为空白对照,1.2.4纯化菌株的拮抗效果测定 参照 Krumholz et al(2009)致病力分级标准进行调 将1.2.3中分离纯化的菌株,真菌采用平板对峙 査,分级标准为:0级:健康植株,无症状;级:整株法、细菌采用滤纸片法分别与病原菌尖孢镰刀菌菌 无变黄叶片;级:全株1/3及以下叶片变黄干枯;株HS2进行对峙培养,每个处理3次重复,以只接种 3级:1/3<全株叶片变黄干枯比例≤1/2;4级:1/2<全菌株HS2的PDA平板作为对照,待对照菌落长满培 株叶片变黄干枯比例≤3/4;5级:全株3/4以上叶片干养皿,测量对峙病原菌半径,计算抑制率,计算方法 枯或死亡。待对照处理植株病级达到3级后统计各同1.2,2,同时测量抑菌带宽度。对于抑制率髙于 处理海棠苗的株高、茎粗、重量、叶面积等生长指标,8000%的菌株进一步开展种类鉴定。 以明确KKM对苹果再植病害的防治效果及对再植1.2.5拮抗菌株的种类鉴定 海棠的促生作用。死亡率=Σ死亡植株/∑调查植 形态特征鉴定:观察PDA平板上拮抗菌株的菌 株×100%;病情指数=Σ(病级x该病级株数)(最高丝形态及生长情况,在显微镜下观察5个视野,共测 病级κ调查株数)×100;防治效果=(对照病情指数-量100个分生孢子;观察生长于BPDA平板上的拮 处理病情指数)对照病情指数×100% 抗细菌菌落形态,鉴定拮抗细菌群体形态特征,并通 1.2.2KMM菌悬液对菌株HS2的拮抗效果测定 过革兰氏染色观察拮抗细菌个体形态特征,参考东 在25℃下培养病原菌尖孢镰刀菌菌株HS2,5d秀珠和蔡妙英(2001)方法进行鉴定。 后在菌落边缘打取直径为6mm的菌盘,在PDA平 生理生化特征测定:参考东秀珠和蔡妙英(2001) 板一侧接入病原菌菌盘。称取10gKKM加入到盛方法进行测定。采用硝酸盐还原试验、耐盐性培养 有90mL灭菌水的三角瓶中,摇匀、静置,取上清液(2%、5%、%、10%)试验、明胶液化、淀粉水解试验 即为KKM菌悬液。在另一侧相距病原菌菌盘4cm乙酰甲基甲醇试验(VP反应)、碳水化合物利用试 处放置1个牛津杯,其中加入200μKMM菌悬液。验(D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇)等进行拮抗 将培养皿置于25℃黑暗恒温培养箱中培养,以分别细菌的生理生化测定 放置200μ的无菌水、恶霉灵原药10倍稀释液的牛 拮抗真菌菌株的分子鉴定:采用转录间隔区 津杯作为空白对照和化学对照,每个处理4次重复。(ITS)序列进行鉴定。刮取覆盖PDA平板上培养的 待空白对照病原菌菌丝长满皿时,测量各处理的菌真菌新鲜菌丝,按照基因组抽提试剂盒说明书进行 落半径和抑菌带宽度,计算KMM菌悬液对菌株DNA提取。采用ITS通用引物ITS1(5- TCCGTAG HS2的抑制率。抑制率=(对照菌落半径-处理菌落 GTGAACCTGCGG-3)和IS4(5°- TCCTCCGCT 半径)对照菌落半径×100%。 TATTGATATGC-3)进行PCR扩增。25μ反应体 123KMM可培养微生物的分离和纯化 系:10× Buffer(缓冲液)2.5山、25mmol/ L MeCI2 称取1gKMM加入到盛有100mL灭菌水的三角20μ、25 mmol/L dNTP15比、5 U/uL Tag0.2uL、 瓶中,将三角瓶置于摇床上以120rmin振荡30min,10 umol/L ITS12.0L、10 umol/L ITS42.0uL、DNA 得到稀释倍数为102的悬浮液,吸取1mL加入到装模板2.0μL,补ddHO至25μ。扩增程序:94℃预
210 植 物 保 护 学 报 46卷 厂；RXZ 型智能人工气候箱，宁波江南仪器厂。 1.2 方法 1.2.1 KMM对苹果再植病害的生防效果测定 尖孢镰刀菌菌株 HS2 在 PDA 培养基上扩繁后 在菌落边缘打取 3 个直径为 6 mm 的菌饼接种到 CMA 培养基上并于 25℃培养，待菌丝长满基质时 取出，放到通风橱中风干后备用。挑选长势一致的 海棠幼苗，按质量比 1% 接种病原菌尖孢镰刀菌菌 株HS2，每处理3次重复，每次重复9棵幼苗。接种 1周后分别用KKM和恶霉灵进行处理。KMM处理 方法为按质量比5%的用量施到口径16 cm×高14 cm 的花盆中，然后浇水 1 000 mL；恶霉灵原药按照说 明书稀释4 000倍后取1 000 mL均匀浇灌于花盆中 作为化学对照，以仅浇水 1 000 mL 作为空白对照， 参照 Krumholz et al.（2009）致病力分级标准进行调 查，分级标准为：0级：健康植株，无症状；1级：整株 无变黄叶片；2 级：全株 1/3 及以下叶片变黄干枯； 3级：1/3<全株叶片变黄干枯比例≤1/2；4级：1/2<全 株叶片变黄干枯比例≤3/4；5级：全株3/4以上叶片干 枯或死亡。待对照处理植株病级达到3级后统计各 处理海棠苗的株高、茎粗、重量、叶面积等生长指标， 以明确KKM对苹果再植病害的防治效果及对再植 海棠的促生作用。死亡率=∑死亡植株/∑调查植 株×100%；病情指数=∑（病级×该病级株数）（/ 最高 病级×调查株数）×100；防治效果=（对照病情指数- 处理病情指数）/对照病情指数×100%。 1.2.2 KMM菌悬液对菌株HS2的拮抗效果测定 在25℃下培养病原菌尖孢镰刀菌菌株HS2，5 d 后在菌落边缘打取直径为6 mm的菌盘，在PDA平 板一侧接入病原菌菌盘。称取10 g KKM加入到盛 有90 mL灭菌水的三角瓶中，摇匀、静置，取上清液 即为KKM菌悬液。在另一侧相距病原菌菌盘4 cm 处放置1个牛津杯，其中加入200 μL KMM菌悬液。 将培养皿置于25℃黑暗恒温培养箱中培养，以分别 放置200 μL的无菌水、恶霉灵原药10倍稀释液的牛 津杯作为空白对照和化学对照，每个处理4次重复。 待空白对照病原菌菌丝长满皿时，测量各处理的菌 落半径和抑菌带宽度，计算 KMM 菌悬液对菌株 HS2的抑制率。抑制率=（对照菌落半径-处理菌落 半径）/对照菌落半径×100%。 1.2.3 KMM可培养微生物的分离和纯化 称取1 g KMM加入到盛有100 mL灭菌水的三角 瓶中，将三角瓶置于摇床上以120 r/min振荡30 min， 得到稀释倍数为10-2 的悬浮液，吸取1 mL加入到装 有9 mL灭菌水的小烧杯中，制成稀释倍数为10-3 的 稀释液，如此依次稀释到 10-6 。取 10-3 、10-4 、10-5 和 10-6 这 4 个梯度的稀释液各 20 μL 分别涂布到马丁 氏平板和 BPDA 平板上，每个稀释度 3 次重复。将 马丁氏平板和 BPDA 平板分别置于 25℃和 37℃恒 温培养箱中黑暗培养。 真菌的纯化：挑取马丁氏平板培养10 d左右的 真菌菌落尖端菌丝，接种到新的马丁氏平板上，待长 出单菌落后通过反复多次挑取尖端菌丝，进行纯化 培养，直到得到纯的单菌落。细菌的纯化：将在BPDA 平板培养 7 d 左右的细菌菌落进行多次划线培 养，获得单菌落。将纯化后的菌株进行编号，并于 4℃保存备用。 1.2.4 纯化菌株的拮抗效果测定 将1.2.3中分离纯化的菌株，真菌采用平板对峙 法、细菌采用滤纸片法分别与病原菌尖孢镰刀菌菌 株HS2进行对峙培养，每个处理3次重复，以只接种 菌株HS2的PDA平板作为对照，待对照菌落长满培 养皿，测量对峙病原菌半径，计算抑制率，计算方法 同 1.2.2，同时测量抑菌带宽度。对于抑制率高于 80.00%的菌株进一步开展种类鉴定。 1.2.5 拮抗菌株的种类鉴定 形态特征鉴定：观察PDA平板上拮抗菌株的菌 丝形态及生长情况，在显微镜下观察5个视野，共测 量 100 个分生孢子；观察生长于 BPDA 平板上的拮 抗细菌菌落形态，鉴定拮抗细菌群体形态特征，并通 过革兰氏染色观察拮抗细菌个体形态特征，参考东 秀珠和蔡妙英（2001）方法进行鉴定。 生理生化特征测定：参考东秀珠和蔡妙英（2001） 方法进行测定。采用硝酸盐还原试验、耐盐性培养 （2%、5%、7%、10%）试验、明胶液化、淀粉水解试验、 乙酰甲基甲醇试验（V-P反应）、碳水化合物利用试 验（D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇）等进行拮抗 细菌的生理生化测定。 拮抗真菌菌株的分子鉴定：采用转录间隔区 （ITS）序列进行鉴定。刮取覆盖PDA平板上培养的 真菌新鲜菌丝，按照基因组抽提试剂盒说明书进行 DNA提取。采用ITS通用引物ITS1（5ʹ-TCCGTAGGTGAACCTGCGG - 3ʹ）和 ITS4（5ʹ - TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ʹ）进行 PCR 扩增。25 μL 反应体 系：10×Buffer（缓冲液）2.5 μL、25 mmol/L MgCl2 2.0 μL、2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL、5 U/μL Taq 0.2 μL、 10 μmol/L ITS1 2.0 μL、10 μmol/L ITS4 2.0 μL、DNA 模板 2.0 μL，补 ddH2O 至 25 μL。扩增程序：94℃预
1期 赵璐等:复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防效果测定及拮抗菌株鉴定 211 变性5min;94℃变性30s,51退火40s,72℃延伸的种属类别。 90s,30个循环;72℃延伸7min,最后于4℃保存。 1.3数据分析 拮抗细菌菌株的分子鉴定:采用gB基因序列 试验数据采用SPSS240软件进行统计分析,应 进行鉴定。按照DNA抽提试剂盒说明书提取DNA用最小显著差数(LSD)法进行差异显著性检验。 并检测,对具有特异性DNA条带的样品进行PCR 扩增,引物为UPlf(5′- GAAGTCATCATGACCGT 2结果与分析 TCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3)和UP2r2.1KMM对苹果再植病害的生防效果 (5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNAC 盆栽试验结果表明,KMM处理对尖孢镰刀菌 RTCNGCRTCNGTCAT-3)。25山反应体系:DNA菌株HS2引起的苹果再植病害防治效果达8778%, 模板1μL、10 umol/L UPIf0.5uL、10mol/LUP2r显著优于化学对照(恶霉灵)及空白对照(表1)。在 0.5L、5U|L7aq酶0.3μ、10× Buffer(缓冲液)对再植海棠苗的生长促进方面,KMM处理的叶面 25μ、10mmol/ L dNTP0.5u,补dHO至25L。积为10.36cm2,显著优于空白对照和恶霉灵对照的 扩增程序:95℃预变性4min;95℃变性1min,58°℃366cm2和443cm2,是后二者的2.83倍和2.34倍。 退火lmin,72℃延伸2min,进行34个循环;最后KMM处理的海棠苗株高可达1412cm,茎粗为 72℃延伸10min,4C临时保存。 020cm,分别为空白对照的1.51倍和200倍,为恶 经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,然后分别将具有霉灵对照的1.53倍和200倍,均差异显著;KMM处 IS序列目的条带、gB阳性克隆条带的PCR产物理的干、鲜重均显著高于空白对照和恶霉灵对照,分 送北京华大基因有限公司进行测序。将测序所得序别是空白对照的574倍和521倍,恶霉灵对照的 列与 Gen Bank中所有已报道的序列进行 BLAST比467倍和429倍,后二者之间在植株的叶面积、株 对,根据比对结果获得相似性高的菌株序列,用高、茎粗、干重及鲜重等生长指标上均无显著差异。 Mega6软件以邻接法构建系统发育树,确定该菌株表明KMM对海棠苗的生长促进作用显著。 表1木美土里复合微生物菌剂对再植盆栽八棱海棠的防病促生作用 Table 1 The control and growth-promoting effect of Kimidori microbial manure against replant disease of Malus robusta in pot experiment 处理 叶面积株高(cm)茎粗(cm)干重(g)鲜重死亡率(%)防治效果(%) Treatment (cm2) (g) Mortality Control Leaf area diameter ght Fresh weight seedlings efficacy 空白对照 Blank cK366±0.20b9.33026b0.10±0.00b0.27±0.0lb0.140.05b63.33±248a 木美土里KMM10.36+0.35a14.12±045a020±0.00a1.544009a0.7340.06a7.37+0.54b87.78±5.74a 恶霉灵 Hymexazol4430.18b9.24024b0.10±000b0.33±0.02b0.17±0.05b5926±364a5.550.25b 表中数据为平均数±标准误。同列不同字母表示经LSD法检验在P<005水平差异显著。 Data are mean+SE. Different let ters in the same column indicate significant difference at P<0.05 level by lsd test. 22KMM菌悬液对菌株HS2的拮抗效果 过8074%(表2),下一步将对这3株菌进行生理生 KKM中的微生物菌群能有效抑制尖孢镰刀菌化特性测定及种类鉴定。 菌株HS2的生长,抑制率可达68.59%,与恶霉灵对2.4拮抗菌株的鉴定 照处理的6681%无显著差异,且形成03cm的抑菌2..1形态学鉴定结果 圈,说明抑菌效果较好。 菌株MMIL-1在PDA培养基上菌落为白色,菌 23KMM可培养微生物的拮抗效果 丝粗而长,长势迅速,菌落较大,分生孢子近球形至 从KKM中共分离到7个真菌分离物和3个细椭圆形,成熟分生孢子呈浅绿色,大小为25~3.5pm 菌分离物,可培养真菌和细菌的含量分别为1.70×2.1~3.0μm(图1-A~C),表现出木霉属的特征。菌株 10°CFU/g和1.84×10CFU/g。对分离微生物的抑BM-01(图1-D)和BM03(图1-E)的菌落表面粗糙, 菌试验结果表明,所有可培养微生物对尖孢镰刀菌典型的火山口状,不透明,污白色或微黄色,较干燥 菌株HS2均有抑制效果,抑制率为488%%~822%,边缘不整齐;菌株BM-01(图1-F)和BM-03(图1-G 其中菌株MMTL-1、BM0和BM-03的抑制率均超均为革兰氏阳性菌,菌体杆状,芽孢较小,椭圆或柱
1期 赵 璐等：复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防效果测定及拮抗菌株鉴定 211 变性5 min；94℃变性30 s，51℃退火40 s，72℃延伸 90 s，30个循环；72℃延伸7 min，最后于4℃保存。 拮抗细菌菌株的分子鉴定：采用gyrB基因序列 进行鉴定。按照DNA抽提试剂盒说明书提取DNA 并检测，对具有特异性 DNA 条带的样品进行 PCR 扩增，引物为 UP1f（5ʹ -GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3ʹ）和 UP2r （5ʹ -AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNAC - RTCNGCRTCNGTCAT-3ʹ）。25 μL 反应体系：DNA 模板 1 μL、10 μmol/L UP1f 0.5 μL、10 μmol/L UP2r 0.5 μL、5 U/μL Taq 酶 0.3 μL、10×Buffer（缓冲液） 2.5 μL、10 mmol/L dNTP 0.5 μL，补ddH2O至25 μL。 扩增程序：95℃预变性4 min；95℃变性1 min，58℃ 退火 1 min，72℃延伸 2 min，进行 34 个循环；最后 72℃延伸10 min，4℃临时保存。 经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，然后分别将具有 ITS序列目的条带、gyrB阳性克隆条带的PCR产物 送北京华大基因有限公司进行测序。将测序所得序 列与GenBank中所有已报道的序列进行BLAST比 对，根据比对结果获得相似性高的菌株序列，用 Mega 6软件以邻接法构建系统发育树，确定该菌株 的种属类别。 1.3 数据分析 试验数据采用SPSS 24.0软件进行统计分析，应 用最小显著差数（LSD）法进行差异显著性检验。 2 结果与分析 2.1 KMM对苹果再植病害的生防效果 盆栽试验结果表明，KMM 处理对尖孢镰刀菌 菌株HS2引起的苹果再植病害防治效果达87.78%， 显著优于化学对照（恶霉灵）及空白对照（表1）。在 对再植海棠苗的生长促进方面，KMM 处理的叶面 积为10.36 cm2 ，显著优于空白对照和恶霉灵对照的 3.66 cm2 和 4.43 cm2 ，是后二者的 2.83 倍和 2.34 倍。 KMM 处理的海棠苗株高可达 14.12 cm，茎粗为 0.20 cm，分别为空白对照的 1.51 倍和 2.00 倍，为恶 霉灵对照的1.53倍和2.00倍，均差异显著；KMM处 理的干、鲜重均显著高于空白对照和恶霉灵对照，分 别是空白对照的 5.74 倍和 5.21 倍，恶霉灵对照的 4.67 倍和 4.29 倍，后二者之间在植株的叶面积、株 高、茎粗、干重及鲜重等生长指标上均无显著差异。 表明KMM对海棠苗的生长促进作用显著。 表1 木美土里复合微生物菌剂对再植盆栽八棱海棠的防病促生作用 Table 1 The control and growth-promoting effect of Kimidori microbial manure against replant disease of Malus robusta in pot experiment 处理 Treatment 空白对照Blank CK 木美土里KMM 恶霉灵Hymexazol 叶面积 （cm2 ） Leaf area 3.66±0.20 b 10.36±0.35 a 4.43±0.18 b 株高（cm） Plant height 9.33±0.26 b 14.12±0.45 a 9.24±0.24 b 茎粗（cm） Stem diameter 0.10±0.00 b 0.20±0.00 a 0.10±0.00 b 干重（g） Dry weight 0.27±0.01 b 1.54±0.09 a 0.33±0.02 b 鲜重 （g） Fresh weight 0.14±0.05 b 0.73±0.06 a 0.17±0.05 b 死亡率（%） Mortality of seedlings 63.33±2.48 a 7.37±0.54 b 59.26±3.64 a 防治效果（%） Control efficacy - 87.78±5.74 a 5.55±0.25 b 表中数据为平均数±标准误。同列不同字母表示经LSD法检验在P<0.05水平差异显著。Data are mean±SE. Different letters in the same column indicate significant difference at P<0.05 level by LSD test. 2.2 KMM菌悬液对菌株HS2的拮抗效果 KKM中的微生物菌群能有效抑制尖孢镰刀菌 菌株 HS2 的生长，抑制率可达 68.59%，与恶霉灵对 照处理的66.81%无显著差异，且形成0.3 cm的抑菌 圈，说明抑菌效果较好。 2.3 KMM可培养微生物的拮抗效果 从 KKM 中共分离到 7 个真菌分离物和 3 个细 菌分离物，可培养真菌和细菌的含量分别为 1.70× 104 CFU/g 和 1.84×106 CFU/g。对分离微生物的抑 菌试验结果表明，所有可培养微生物对尖孢镰刀菌 菌株HS2均有抑制效果，抑制率为48.89%~82.22%， 其中菌株MMTL-1、BM-01和BM-03的抑制率均超 过 80.74%（表 2），下一步将对这 3 株菌进行生理生 化特性测定及种类鉴定。 2.4 拮抗菌株的鉴定 2.4.1 形态学鉴定结果 菌株MMTL-1在PDA培养基上菌落为白色，菌 丝粗而长，长势迅速，菌落较大，分生孢子近球形至 椭圆形，成熟分生孢子呈浅绿色，大小为2.5~3.5 μm× 2.1~3.0 μm（图1-A~C），表现出木霉属的特征。菌株 BM-01（图1-D）和BM-03（图1-E）的菌落表面粗糙， 典型的火山口状，不透明，污白色或微黄色，较干燥， 边缘不整齐；菌株BM-01（图1-F）和BM-03（图1-G） 均为革兰氏阳性菌，菌体杆状，芽孢较小，椭圆或柱
212 植物保护学报 46卷 状芽孢,位于菌体中央或稍偏,形成芽孢,表明菌株BM-01和BM-03具有典型的芽胞杆菌属特征。 表2木美土里复合微生物菌剂分离菌株对尖孢镰刀菌菌株HS2的抑制效果 Table 2 Inhibitory effect of culturable microorganisms from Kimidori microbial manure against Fusarium oxysporum strain HS2 菌株 数量(x×10CFU/g)占各自类型的比例(%) 抑制率(%) Strain Colony-forming unit Percentage of each type MMTL-I 真菌 Fungi 8148±963a MMTL-2 真菌 Fungi 64.71 58.52±5.19b MMTL-3 真菌 Fungi 6296±707b MMTL-4 真菌 Fungi 9.82 57.04±6.06b 真菌 Fungi 1.33 48.89±1.28c MMTL-6 真菌 Fungi 48.89±2.57c MMTL-7 真菌 Fungi 60.00±588b BM-01 困 45.65 BM-02 细菌 Bacteria 520.00 28.26 71.11±0.00a BM-03 细菌 Bacteria 480.00 80.74±148a 表中数据为平均数±标准误。同列不同字母表示经LSD法检验在P<005水平差异显著。 Data are mean+SE. Different let ters in the same column indicate significant difference at P<0.05 level by LSD test. 10 2 , ● ump 图1拮抗菌株MMIL1、BM-01和BM03的菌落形态和镜检形态 Fig 1 Colony and microscopic morphology of strains of MMTL-l, BM-0I and BM-0 A:菌株MMIL-1的菌落;B~C:分别为菌株MMIL-1的40×和100×显微镜下的分生孢子;DE:分别为菌株BM1和 BM03的菌落;F~G:分别为菌株BM01和BM03的芽孢。A: Colony of strain MMTL-1;B-C: conidiophores of strain MMTL-1 at 40x and 100x microscopes respectively; D-E: colonies of strains BM-01 and BM-03 respectively: F-G: spores of strains BM-01 tively
212 植 物 保 护 学 报 46卷 状芽孢，位于菌体中央或稍偏，形成芽孢，表明菌株 BM-01和BM-03具有典型的芽胞杆菌属特征。 表2 木美土里复合微生物菌剂分离菌株对尖孢镰刀菌菌株HS2的抑制效果 Table 2 Inhibitory effect of culturable microorganisms from Kimidori microbial manure against Fusarium oxysporum strain HS2 菌株 Strain MMTL-1 MMTL-2 MMTL-3 MMTL-4 MMTL-5 MMTL-6 MMTL-7 BM-01 BM-02 BM-03 类型 Type 真菌Fungi 真菌Fungi 真菌Fungi 真菌Fungi 真菌Fungi 真菌Fungi 真菌Fungi 细菌Bacteria 细菌Bacteria 细菌Bacteria 数量（×103 CFU/g） Colony-forming unit 1.67 11.00 0.67 1.67 1.33 0.33 0.33 840.00 520.00 480.00 占各自类型的比例（%） Percentage of each type 9.82 64.71 3.94 9.82 7.82 1.94 1.94 45.65 28.26 26.09 抑制率（%） Inhibition rate 81.48±9.63 a 58.52±5.19 b 62.96±7.07 b 57.04±6.06 b 48.89±1.28 c 48.89±2.57 c 60.00±5.88 b 82.22±1.28 a 71.11±0.00 a 80.74±1.48 a 表中数据为平均数±标准误。同列不同字母表示经LSD法检验在P<0.05水平差异显著。Data are mean±SE. Different letters in the same column indicate significant difference at P<0.05 level by LSD test. 图1 拮抗菌株MMTL-1、BM-01和BM-03的菌落形态和镜检形态 Fig. 1 Colony and microscopic morphology of strains of MMTL-1，BM-01 and BM-03 A：菌株MMTL-1的菌落；B~C：分别为菌株MMTL-1的40×和100×显微镜下的分生孢子；D~E：分别为菌株BM-01和 BM-03的菌落；F~G：分别为菌株BM-01和BM-03的芽孢。A：Colony of strain MMTL-1；B-C：conidiophores of strain MMTL-1 at 40× and 100× microscopes respectively；D-E：colonies of strains BM-01 and BM-03 respectively；F-G：spores of strains BM-01 and BM-03 respectively
1期 赵璐等:复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防效果测定及拮抗菌株鉴定 213 242细菌BM-01和BM03的生理生化鉴定结果2.43分子生物学鉴定结果 细菌菌株BM-01、BM-03能发酵葡萄糖、麦芽 从菌株MMTL-1基因组DNA中扩增出约500bp 糖,硝酸盐还原反应生成红色化合物,可水解淀粉,的IS片段,经过序列对比与哈茨木霉 Trichoderma 明胶液化呈阳性,L-阿拉伯糖、甘露醇呈阳性,脂酶ha=iam、黄绿木霉T. aureoviride、非洲哈茨木霉 测定、甲基红试验、吲哚反应呈阴性,v-P测定能生T. froharzianum等菌株IS序列的相似度都在 成红色化合物。菌株BM-01不能利用乳糖,在加入9900%以上,选取10株相似度较高的木霉菌ITS序 2%~-10%NaCl的BPDA培养基上能生长;菌株BM-列与待测菌株MMIL-1的ITS序列构建系统发育 03能利用乳糖,在加入10%NaCl的BPDA培养基上树,发现MMIL-1菌株与哈茨木霉位于一个分支 不能生长。表明菌株BM-01和BM-03的生理生化上,相似度最高(图2)。结合形态鉴定结果,将菌株 特征与芽胞杆属细菌接近。 MMTL-1鉴定为哈茨木霉Thr= ranum Trichoderma aureoviride(HQ596956) Trichoderma harzianum(KY225675 Trichoderma aureoviride(FJ610307) 0.001 14 Trichoderma harzianum(FJ442645) Trichoderma afroharzianum(KX357834) Trichoderma harzianum(AF055215) Trichoderma harzianum(KY225671) Trichoderma harzianum(KR86824 Trichoderma harzianum(AF278790) 2基于IIS序列构建菌株MMTL-1与其相关菌株的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic analysis of strain MMTL-I and other related strains based on the ITS sequences 菌株BM1和BM03的gB扩增片段约为度较高的芽胞杆菌gB序列与待测菌株BM01 1200bp,经过序列比对发现与解淀粉芽胞杆菌B.BM-03的grB序列构建系统发育树,发现菌株BM- amyloliquefaciens、甲基营养型芽胞杆菌B. methyl-01和BM03与解淀粉芽胞杆菌位于一个分支上,相 opticus、贝菜斯芽胞杆菌B. pelewensis等菌株的似度最高(图3)。结合形态和生理生化鉴定结果 gB序列相似度都在9800%以上,选取12株相似将菌株BM-01和BM-03鉴定为解淀粉芽胞杆菌。 Bacillus amyloliquefaciens (JQ658430) Bacillus velezensis( CP01541 7) 100BM-0 Bacillus amyloliquefaciens(JNO86139.1) Bacillus amyloliquefaciens(CP013727) Bacillus velezensis(CP0225: Bacillus velezensis(LC191187) 55 Bacillus velezensis(CP022654 62 Bacillus velezensis(CP015443) 64 Bacillus methylotrophus( CPO1 1937) o Bacillus velezensis( CP018007) 3基于gB基因序列构建菌株BM-01和BM03与其相关菌株的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic analysis of strains BM-01, BM-03 and other related strains based on the gyrB gene sequences 3讨论 映木美土里复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防 效果,结果表明该菌剂对海棠苗的株高、茎粗、重量、 目前,关于苹果再植病害的生防效果指标缺乏叶面积等生长指标均有促进作用,且对苹果再植病 统一的标准,田间试验中多将新枝伸长长度、干重、的防治效果显著,显著优于常用于防治土传病害的 茎粗增量、株高及果实中各物质含量作为测量指标化学药剂恶霉灵(庄敬华等,2005),这在生产中较罕 ( Manic et al,2013; Liu et al,2014)。本研究选择见。分析可能的原因有2个,一是盆栽土壤环境相 株高、茎粗、干重、鲜重及叶面积等生长势指标来反对于大田比较简单,有利于木美土里复合微生物菌
1期 赵 璐等：复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防效果测定及拮抗菌株鉴定 213 2.4.2 细菌BM-01和BM-03的生理生化鉴定结果 细菌菌株 BM-01、BM-03 能发酵葡萄糖、麦芽 糖，硝酸盐还原反应生成红色化合物，可水解淀粉， 明胶液化呈阳性，L-阿拉伯糖、甘露醇呈阳性，脂酶 测定、甲基红试验、吲哚反应呈阴性，V-P测定能生 成红色化合物。菌株BM-01不能利用乳糖，在加入 2%~10% NaCl的BPDA培养基上能生长；菌株BM- 03能利用乳糖，在加入10% NaCl的BPDA培养基上 不能生长。表明菌株BM-01和BM-03的生理生化 特征与芽胞杆属细菌接近。 2.4.3 分子生物学鉴定结果 从菌株MMTL-1基因组DNA中扩增出约500 bp 的ITS片段，经过序列对比与哈茨木霉Trichoderma harzianum、黄绿木霉 T. aureoviride、非洲哈茨木霉 T. afroharzianum 等 菌 株 ITS 序 列 的 相 似 度 都 在 99.00%以上，选取10株相似度较高的木霉菌ITS序 列与待测菌株 MMTL-1 的 ITS 序列构建系统发育 树，发现 MMTL-1 菌株与哈茨木霉位于一个分支 上，相似度最高（图2）。结合形态鉴定结果，将菌株 MMTL-1鉴定为哈茨木霉T. harzianum。 图2 基于ITS序列构建菌株MMTL-1与其相关菌株的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic analysis of strain MMTL-1 and other related strains based on the ITS sequences 菌株 BM-01 和 BM-03 的 gyrB 扩增片段约为 1 200 bp，经过序列比对发现与解淀粉芽胞杆菌 B. amyloliquefaciens、甲基营养型芽胞杆菌 B. methylotrophicus、贝莱斯芽胞杆菌 B. velezensis 等菌株的 gyrB 序列相似度都在 98.00% 以上，选取 12 株相似 度较高的芽胞杆菌 gyrB 序列与待测菌株 BM-01、 BM-03的gyrB序列构建系统发育树，发现菌株BM- 01和BM-03与解淀粉芽胞杆菌位于一个分支上，相 似度最高（图 3）。结合形态和生理生化鉴定结果， 将菌株BM-01和BM-03鉴定为解淀粉芽胞杆菌。 图3 基于gyrB基因序列构建菌株BM-01和BM-03与其相关菌株的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic analysis of strains BM-01，BM-03 and other related strains based on the gyrB gene sequences 3 讨论 目前，关于苹果再植病害的生防效果指标缺乏 统一的标准，田间试验中多将新枝伸长长度、干重、 茎粗增量、株高及果实中各物质含量作为测量指标 （Manici et al.，2013；Liu et al.，2014）。本研究选择 株高、茎粗、干重、鲜重及叶面积等生长势指标来反 映木美土里复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防 效果，结果表明该菌剂对海棠苗的株高、茎粗、重量、 叶面积等生长指标均有促进作用，且对苹果再植病 的防治效果显著，显著优于常用于防治土传病害的 化学药剂恶霉灵（庄敬华等，2005），这在生产中较罕 见。分析可能的原因有2个，一是盆栽土壤环境相 对于大田比较简单，有利于木美土里复合微生物菌
214 植物保护学报 46卷 剂中的拮抗微生物发挥作用;二是木美土里复合微论基础。 生物菌剂不仅含有微生物,其作为肥的功效也相当 显著,具有促进幼苗生长的作用,这与刘旭等(2010) 参考文献( References) 的研究结果一致。 Biro B, Magyar K, Varady GY, Kecskes M. 1998. Specific replant dis- 本研究通过对分离所得拮抗菌株的 ITS/gyrB序 ease reduced by PGPR rhizobacteria on apple seedlings. Acta Hor- 列进行分析,并结合形态特征观察来判断该菌株的 ticulturae. 477: 75-81 归属。拮抗菌株所表现出的形态特征及其相应的序 Braun PG. 1995. Effects of Cylindrocarpon and Pythium species on ap- 列分析所得结果基本一致。表明依据形态特征、分 ple seedlings and potential role in apple replant disease. Canadian Journal of Plant Pathology, 17(4): 336-341 子序列分析对该菌株进行分类鉴定,其结果是可信 Caska v, Hudska g.199. Use of4 grobacterium radiobacter for 的(孙卓和杨利民,2015;周登博等,2016)。本研究 logical control of apple replant disease. Acta Horticulturae, 324 筛选到的3株拮抗菌被鉴定为哈茨木霉与解淀粉芽 67-72 胞杆菌,木霉菌作为一种生防菌已广泛应用于防治 heng LJ, Xue QH. 2012. Laboratory manual of microbiology(2nd edition). beijing; Science press( (in Chinese)[程丽娟,薛泉宏 各类植物病害( Forge et al,2016),芽胞杆菌是土壤 012.微生物学实验技术(第2版)北京:科学出版社] 微生态的一种优势种群能形成具有较强抗逆能力 Dong xI,caiM:20. Handbook of systematic identification of 的芽孢,有利于其在生物有机肥的生产、加工及在土 common bacteria. Beijing: Science Press, pp. 349-388(in Chi 壤环境中存活、定殖与繁殖(梅新兰等,2010),表明 nese)[东秀珠,蔡妙英.2001.常见细菌系统鉴定手册北京:科 通过本试验鉴定筛选到的拮抗菌的方法准确可信 学出版社,p.349-388 且此结果与木美土里复合微生物菌剂防病促生的特 Forge T, Neilsen G, Neilsen D. 2016. Organically acceptable practices to improve replant success of temperate tree-fruit crops. Scientia 性相一致。 Horticulturae. 200- 205-214 本研究在前期开展了大田试验的基础上,在盆Huoy,LuLw,Lux, Dang JM,Fan, Wang ST, Cao Ko.2015 栽海棠幼苗上通过可控试验进一步明确了木美土里 Evaluation of the effect of Kimidori bioorganic fertilizer on the 复合微生物菌剂对再植病害的生防效果,并对菌剂 control of apple canker disease. China Fruits, (4): 52-55(in Chi- 中的几种可分离微生物进行了分离培养和室内拮抗 nese)[胡清玉,刘力伟,刘欣,党建美,范军印,王树桐,曹克强 2015.木美土里生物菌肥对苹果树腐烂病的防治作用评价.中 效果测试,进而对拮抗效果较好的3株菌株进行了 国果树,(452-55 鉴定。这一研究思路与常见研究思路有所不同。已 Jiang YM. Ge SI:2016. A coup for apple orchard to"rejuvenate by 有研究报道多数是从筛选微生物菌株入手,通过大 improving the soil and reducing the fertilizer. Farmers Daily, 10- 量筛选微生物,获得拮抗作用较强的微生物菌株,然07)( n chinese)姜远茂,葛顺峰2016.苹果园“返老还童”改 后针对该菌株开展较为深入的理论研究。但是这些 土减肥有妙招.农民日报,10-207) 菌株离生产应用还相距甚远,很多菌株因不能用于 Kandula DRW, Jones EE, Homer IJ, Stewart A. 2010. The effect of Trichoderma bio-inoculants on specific apple replant disease 生产制剂或田间试验防治效果不稳定(张瑜,2007), (SARD) symptoms in apple rootstocks in New Zealand. Austral 而在经过大量研究后被放弃,浪费了人力物力。本 asian Plant Pathology, 39(4): 312-318 研究选用的微生物菌剂已经在生产中得到较为广泛 Krumholz MR, Klein RI, McKee c;, Offner ssr, Cunningham AJ 的应用,这就解决了菌株的实用性问题。同时,市场 2009. The formation of massive star systems by accretion. Sci- 上的菌剂多种多样,但这些菌剂多以肥料进行登记, ence,323(5915):754-757 对再植病害的防治效果难以确定,推广应用存在很 BZ, Wang YJ, Wang XL 2013. The effect of Kimidori fertilizer on the control of apple scar skin and canker disease. Yantai Fruits, 大的隐患。而本研究明确了木美土里复合微生物菌 (3):10-12( (in Chinese)[李丙智,王洋娟,王晓琳.2013.木美土 剂对再植病害的防治效果,有助于其推广应用,也为 里防控苹果花脸及腐烂病的效果试验.烟台果树,(3):10-12 在苹果生产中制定切实可行的再植病害解决方案提LiuE, Wang Gs, Li YY, Shen X, Chen Xs, Song FH, Wu SJ, Chen Q, 供了技术和物质储备。此外,木美土里复合微生物 Mao zQ. 2014. Replanting affects the tree growth and fruit quali- 菌剂的菌种从国外引进,其种类组成并无报道,本试 ty of Gala apple. Journal of Integrative Agriculture, 13(8): 1699- 验对可分离菌株进行了分离和鉴定,对于明确其菌1m12090 international competition ability research of China a 种组成并获得高效拮抗菌株,进而为下一步深入开 ple industry. Master Thesis. Yangling: Northwest A&F University 发并最终形成自主创新的复合微生物菌剂奠定了理 in Chinese)[刘婧.2009中国苹果产业国际竞争力研究.硕士
214 植 物 保 护 学 报 46卷 剂中的拮抗微生物发挥作用；二是木美土里复合微 生物菌剂不仅含有微生物，其作为肥的功效也相当 显著，具有促进幼苗生长的作用，这与刘旭等（2010） 的研究结果一致。 本研究通过对分离所得拮抗菌株的ITS/gyrB序 列进行分析，并结合形态特征观察来判断该菌株的 归属。拮抗菌株所表现出的形态特征及其相应的序 列分析所得结果基本一致。表明依据形态特征、分 子序列分析对该菌株进行分类鉴定，其结果是可信 的（孙卓和杨利民，2015；周登博等，2016）。本研究 筛选到的3株拮抗菌被鉴定为哈茨木霉与解淀粉芽 胞杆菌，木霉菌作为一种生防菌已广泛应用于防治 各类植物病害（Forge et al.，2016），芽胞杆菌是土壤 微生态的一种优势种群，能形成具有较强抗逆能力 的芽孢，有利于其在生物有机肥的生产、加工及在土 壤环境中存活、定殖与繁殖（梅新兰等，2010），表明 通过本试验鉴定筛选到的拮抗菌的方法准确可信， 且此结果与木美土里复合微生物菌剂防病促生的特 性相一致。 本研究在前期开展了大田试验的基础上，在盆 栽海棠幼苗上通过可控试验进一步明确了木美土里 复合微生物菌剂对再植病害的生防效果，并对菌剂 中的几种可分离微生物进行了分离培养和室内拮抗 效果测试，进而对拮抗效果较好的3株菌株进行了 鉴定。这一研究思路与常见研究思路有所不同。已 有研究报道多数是从筛选微生物菌株入手，通过大 量筛选微生物，获得拮抗作用较强的微生物菌株，然 后针对该菌株开展较为深入的理论研究。但是这些 菌株离生产应用还相距甚远，很多菌株因不能用于 生产制剂或田间试验防治效果不稳定（张瑜，2007）， 而在经过大量研究后被放弃，浪费了人力物力。本 研究选用的微生物菌剂已经在生产中得到较为广泛 的应用，这就解决了菌株的实用性问题。同时，市场 上的菌剂多种多样，但这些菌剂多以肥料进行登记， 对再植病害的防治效果难以确定，推广应用存在很 大的隐患。而本研究明确了木美土里复合微生物菌 剂对再植病害的防治效果，有助于其推广应用，也为 在苹果生产中制定切实可行的再植病害解决方案提 供了技术和物质储备。此外，木美土里复合微生物 菌剂的菌种从国外引进，其种类组成并无报道，本试 验对可分离菌株进行了分离和鉴定，对于明确其菌 种组成并获得高效拮抗菌株，进而为下一步深入开 发并最终形成自主创新的复合微生物菌剂奠定了理 论基础。 参 考 文 献（References） Biro B, Magyar K, Varady GY, Kecskes M. 1998. Specific replant disease reduced by PGPR rhizobacteria on apple seedlings. Acta Horticulturae, 477: 75-81 Braun PG. 1995. Effects of Cylindrocarpon and Pythium species on apple seedlings and potential role in apple replant disease. Canadian Journal of Plant Pathology, 17(4): 336-341 Catska V, Hudska G. 1993. Use of Agrobacterium radiobacter for biological control of apple replant disease. Acta Horticulturae, 324: 67-72 Cheng LJ, Xue QH. 2012. Laboratory manual of microbiology (2nd edition). Beijing: Science Press (in Chinese) [程丽娟, 薛泉宏 . 2012. 微生物学实验技术(第2版). 北京: 科学出版社] Dong XZ, Cai MY. 2001. Handbook of systematic identification of common bacteria. Beijing: Science Press, pp. 349-388 (in Chinese) [东秀珠, 蔡妙英. 2001. 常见细菌系统鉴定手册. 北京: 科 学出版社, pp. 349-388] Forge T, Neilsen G, Neilsen D. 2016. Organically acceptable practices to improve replant success of temperate tree-fruit crops. Scientia Horticulturae, 200: 205-214 Hu QY, Liu LW, Liu X, Dang JM, Fan JY, Wang ST, Cao KQ. 2015. Evaluation of the effect of Kimidori bioorganic fertilizer on the control of apple canker disease. China Fruits, (4): 52-55 (in Chinese) [胡清玉, 刘力伟, 刘欣, 党建美, 范军印, 王树桐, 曹克强. 2015. 木美土里生物菌肥对苹果树腐烂病的防治作用评价. 中 国果树, (4): 52-55] Jiang YM, Ge SF. 2016. A coup for apple orchard to“rejuvenate”by improving the soil and reducing the fertilizer. Farmers Daily, 10- 20(7) (in Chinese) [姜远茂, 葛顺峰. 2016. 苹果园“返老还童”改 土减肥有妙招. 农民日报, 10-20(7)] Kandula DRW, Jones EE, Horner IJ, Stewart A. 2010. The effect of Trichoderma bio-inoculants on specific apple replant disease (SARD) symptoms in apple rootstocks in New Zealand. Australasian Plant Pathology, 39(4): 312-318 Krumholz MR, Klein RI, McKee CF, Offner SSR, Cunningham AJ. 2009. The formation of massive star systems by accretion. Science, 323(5915): 754-757 Li BZ, Wang YJ, Wang XL. 2013. The effect of Kimidori fertilizer on the control of apple scar skin and canker disease. Yantai Fruits, (3): 10-12 (in Chinese) [李丙智, 王洋娟, 王晓琳. 2013. 木美土 里防控苹果花脸及腐烂病的效果试验. 烟台果树, (3): 10-12] Liu ET, Wang GS, Li YY, Shen X, Chen XS, Song FH, Wu SJ, Chen Q, Mao ZQ. 2014. Replanting affects the tree growth and fruit quality of Gala apple. Journal of Integrative Agriculture, 13(8): 1699- 1706 Liu J. 2009. The international competition ability research of China apple industry. Master Thesis. Yangling: Northwest A&F University (in Chinese) [刘婧. 2009. 中国苹果产业国际竞争力研究. 硕士
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