第十三章多肽与蛋白质类药物 第一节多肽及蛋白质类药物的生产方法 蛋白质类药物的分离与纯化 (一)材料选择 蛋白质类药物的原料来源有动植物组织和微生物等, 原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的、易于获 得和易于提取的无害生物材料 对天然蛋白质类药物,为提高质量、产量和降低生 产成本,对原料的种属、发育阶段、生物状态、来 源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞都有 定的要求,了解这可使分离纯化工作事半功倍
第十三章 多肽与蛋白质类药物 第一节 多肽及蛋白质类药物的生产方法 一、蛋白质类药物的分离与纯化 （一）材料选择 蛋白质类药物的原料来源有动植物组织和微生物等， 原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的、易于获 得和易于提取的无害生物材料。 对天然蛋白质类药物，为提高质量、产量和降低生 产成本，对原料的种属、发育阶段、生物状态、来 源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞都有 一定的要求，了解这可使分离纯化工作事半功倍
(1)种属牛胰含胰岛素单位比猪胰髙,牛为4000JU /kg胰脏,猪为3000U/kg胰脏。抗原性猪比牛的低 前者与人胰岛素相比,只有1个氨基酸的差异,而牛 有3个氨基酸的差异 (2)发育生长阶段幼年动物的胸腺比较发达,老龄 后逐渐萎缩,因此胸腺原料必须采自幼龄动物 HCG在妊娠妇女60~70天的尿中达到高峰;到妊 娠18周已降到最低水平。然而HMC必须从绝经期的妇 女尿中获取 肝细胞生长因子是从肝细胞分化最旺盛阶段的胎 儿、胎猪或胎牛肝中获得的。若用成年动物,必须经 过肝脏部分切除手术后,才能获得富含肝细胞生长因 子的原料
（1）种属 牛胰含胰岛素单位比猪胰高，牛为4000IU ／kg胰脏，猪为3000IU／kg胰脏。抗原性猪比牛的低。 前者与人胰岛素相比，只有1个氨基酸的差异，而牛 有3个氨基酸的差异。 （2）发育生长阶段 幼年动物的胸腺比较发达，老龄 后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须采自幼龄动物。 HCG在妊娠妇女60～70天的尿中达到高峰；到妊 娠18周已降到最低水平。然而HMC必须从绝经期的妇 女尿中获取。 肝细胞生长因子是从肝细胞分化最旺盛阶段的胎 儿、胎猪或胎牛肝中获得的。若用成年动物，必须经 过肝脏部分切除手术后，才能获得富含肝细胞生长因 子的原料
(3)生物状态动物饱食后宰杀,胰脏中的胰岛素含 量增加,对提取胰岛素有利,但胆囊收缩素的分泌使 胆汁排空,对胆汁的收集不利。严重再生障碍性贫 血症患者尿中的EPO含量增加。 (4)原料来源血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚 下腺中提取,而稳定性以颚下腺来源为好,因其不含 蛋白水解酶。 (5)原料解剖学部位猪胰脏中,胰尾部分含激素 较多,而胰头部分含消化酶较多。如分别摘取则可提 高各产品的收率。 胃膜素以采取全胃粘膜为好,胃蛋白酶则以采取胃 底部粘膜为好,因胃底部粘膜富含消化腺
（3）生物状态 动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素含 量增加，对提取胰岛素有利，但胆囊收缩素的分泌使 胆汁排空，对胆汁的收集不利。严重再生障碍性贫 血症患者尿中的EPO含量增加。 （4）原料来源 血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚 下腺中提取，而稳定性以颚下腺来源为好，因其不含 蛋白水解酶。 （5）原料解剖学部位 猪胰脏中，胰尾部分含激素 较多，而胰头部分含消化酶较多。如分别摘取则可提 高各产品的收率。 胃膜素以采取全胃粘膜为好，胃蛋白酶则以采取胃 底部粘膜为好，因胃底部粘膜富含消化腺
(6)对生物技术产品宿主菌或细胞的要求 选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑 到后处理的问题。大肠杆菌表达,由于其不能将所表 达的蛋白质分泌到体外,故提取时必须破壁,增加了 提取的困难,而且还可能含有毒素类有害因子 用枯草杆菌或酵母菌作宿主菌,虽可解决这一矛 盾,但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基化等翻译及修 饰的缺陷; 用动物细胞和昆虫细胞表达则能比较好地解决后 处理及完整表达的问题。 用肿瘤细胞作宿主细胞制成的医药产品还应考虑 到其安全性问题
（6）对生物技术产品宿主菌或细胞的要求 选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑 到后处理的问题。大肠杆菌表达，由于其不能将所表 达的蛋白质分泌到体外，故提取时必须破壁，增加了 提取的困难，而且还可能含有毒素类有害因子。 用枯草杆菌或酵母菌作宿主菌，虽可解决这一矛 盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基化等翻译及修 饰的缺陷； 用动物细胞和昆虫细胞表达则能比较好地解决后 处理及完整表达的问题。 用肿瘤细胞作宿主细胞制成的医药产品还应考虑 到其安全性问题
(二)蛋白质提纯的一般方法 根据蛋白质在溶液中的下列性质分离蛋白质:分 子大小、溶解度、电荷、吸附性质、对其他分子的 生物亲和力等。 1、根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质 蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质,在一定 pH环境中,某一种蛋白质解离成正、负离子的趋势 相等,或解离成两性离子,其净电荷为零,此时环 境的pH值即为该蛋白质的等电点。在等电点时蛋白 质性质比较稳定,其物理性质如导电性、溶解度、 粘度、渗透压等皆最小,因此可利用蛋白质等电点 时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质
（二）蛋白质提纯的一般方法 根据蛋白质在溶液中的下列性质分离蛋白质：分 子大小、溶解度、电荷、吸附性质、对其他分子的 生物亲和力等。 1、根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质 蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质，在一定 pH环境中，某一种蛋白质解离成正、负离子的趋势 相等，或解离成两性离子，其净电荷为零，此时环 境的pH值即为该蛋白质的等电点。在等电点时蛋白 质性质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度、 粘度、渗透压等皆最小，因此可利用蛋白质等电点 时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质
两性物质的等电点会因条件不同(如在不同离子 强度的不同缓冲溶液中,或含有一定的有机溶媒的 溶液中)而改变。当盐存在时,蛋白质若结合了较 多的阳离子,则等电点向较高的pH值偏移。反之 蛋白质若结合较多的阴离子,则等电点移向较低的 pH值 用等电点法沉淀蛋白质常需配合盐析操作,而除 去不需要的杂蛋白时,常需配合热变性操作。 等电聚焦电泳除了用于分离蛋白质外,也可用于 测定蛋白质的等电点
两性物质的等电点会因条件不同（如在不同离子 强度的不同缓冲溶液中，或含有一定的有机溶媒的 溶液中）而改变。当盐存在时，蛋白质若结合了较 多的阳离子，则等电点向较高的pH值偏移。反之， 蛋白质若结合较多的阴离子，则等电点移向较低的 pH值。 用等电点法沉淀蛋白质常需配合盐析操作，而除 去不需要的杂蛋白时，常需配合热变性操作。 等电聚焦电泳除了用于分离蛋白质外，也可用于 测定蛋白质的等电点
2、根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质 蛋白质的一个主要特点是分子大。由此可以用凝胶 过滤法、超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其 他小分子物质分离,也可将大小不同的蛋白质分离。 I注意]用超滤法时,超滤膜截留分子量常与实际情 况不一致。分子量相近的蛋白质由于在介质中有呈线 形溶质或者是球形溶质的区别,可能出现不同的结 果 葡聚糖凝胶含有少量的酸性基团,故有较弱的离 子交换作用,此外还有吸附作用。在纯化蛋白质时, 可采用低浓度的盐溶液(0.01mol/L),或者用与 待分离蛋白质相同的标准蛋白质预先使凝胶柱平衡 以期不损失所分离的蛋白质
2、根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质 蛋白质的一个主要特点是分子大。由此可以用凝胶 过滤法、超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其 他小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离。 [注意] 用超滤法时，超滤膜截留分子量常与实际情 况不一致。分子量相近的蛋白质由于在介质中有呈线 形溶质或者是球形溶质的区别，可能出现不同的结 果。 葡聚糖凝胶含有少量的酸性基团，故有较弱的离 子交换作用，此外还有吸附作用。在纯化蛋白质时， 可采用低浓度的盐溶液（0.01mol／L），或者用与 待分离蛋白质相同的标准蛋白质预先使凝胶柱平衡， 以期不损失所分离的蛋白质
3、根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋自质 蛋白质的溶解度受溶液的pH、离子强度、溶剂的 电解质性质及温度等多种因素的影响。在同一特定条 件下,不同蛋白质有不同的溶解度,适当改变外界条 件,可以有选择地控制某一种蛋白质的溶解度,达到 分离的目的。 属于这一类的分离方法有蛋白质的盐溶与盐析法、 结晶法和低温有机溶剂沉淀法 乙醇和丙酮是有机溶剂沉淀法中最常用的有机溶 剂,由于丙酮的介电常数小于乙醇,故丙酮沉淀能力 比乙醇强
3、根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋自质 蛋白质的溶解度受溶液的pH、离子强度、溶剂的 电解质性质及温度等多种因素的影响。在同一特定条 件下，不同蛋白质有不同的溶解度，适当改变外界条 件，可以有选择地控制某一种蛋白质的溶解度，达到 分离的目的。 属于这一类的分离方法有蛋白质的盐溶与盐析法、 结晶法和低温有机溶剂沉淀法。 乙醇和丙酮是有机溶剂沉淀法中最常用的有机溶 剂，由于丙酮的介电常数小于乙醇，故丙酮沉淀能力 比乙醇强
根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质 离子交换剂作为一种固定相,本身具有正离子或负 离子基团,它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲 和力,从而使这些物质分离提纯 蛋白质、多肽或氨基酸具有能够离子化的基团。对 蛋白质的离子交换层析,一般多用离子交换纤维和以 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为骨架 的离子交换剂。主要是取其有较大的蛋白质吸附容量、 较高的流速和分辨率等优点。 对已知等电点的物质,在pH高于其等电点时,用 阴离子交换剂,在低于其等电点时,用阳离子交换剂
4、根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质 离子交换剂作为一种固定相，本身具有正离子或负 离子基团，它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲 和力，从而使这些物质分离提纯。 蛋白质、多肽或氨基酸具有能够离子化的基团。对 蛋白质的离子交换层析，一般多用离子交换纤维和以 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为骨架 的离子交换剂。主要是取其有较大的蛋白质吸附容量、 较高的流速和分辨率等优点。 对已知等电点的物质，在pH高于其等电点时，用 阴离子交换剂，在低于其等电点时，用阳离子交换剂
5、根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质 主要的手段是亲和层析法,即利用蛋白质分子能与 其相应的配体进行特异的、非共价键的可逆性结合 而达到纯化的目的 注意]非专一性吸附主要来自吸附剂上的离子基团 和疏水基团。解决这一问题的方法是从制备和选用吸 附剂上着手 固相化金属亲和层析(MAC)是新发展的种亲 和层析技术。蛋白质分子中的咪唑基和巯基可与一些 金属元素(如Cu2+、Zn2+等)形成配位结合,使蛋 白质得到分离纯化
5、根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质 主要的手段是亲和层析法，即利用蛋白质分子能与 其相应的配体进行特异的、非共价键的可逆性结合 而达到纯化的目的。 [注意] 非专一性吸附主要来自吸附剂上的离子基团 和疏水基团。解决这一问题的方法是从制备和选用吸 附剂上着手。 固相化金属亲和层析（IMAC）是新发展的一种亲 和层析技术。蛋白质分子中的咪唑基和巯基可与一些 金属元素（如Cu2＋ 、Zn2+等）形成配位结合，使蛋 白质得到分离纯化