第十四章核酸类药物 第一节核酸类物质的分离提取及其发酵生产 RNA与DNA的提取与制备 ()RNA的提取与制备 工业用RNA的提取 (1)RNA及其工业来源从微生物中提取RNA是工 业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰 富的核酸资源,如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝 体——青霉素,制霉菌素等菌体。 通常在细菌中RNA占5%~25%,在酵母中占27 6~15%,在霉菌中占07%~28%
第十四章 核酸类药物 第一节 核酸类物质的分离提取及其发酵生产 一、RNA与DNA的提取与制备 （一）RNA的提取与制备 1、工业用RNA的提取 （1）RNA及其工业来源 从微生物中提取RNA是工 业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰 富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝 体——青霉素，制霉菌素等菌体。 通常在细菌中RNA占5％～25％，在酵母中占2.7 ％～15％，在霉菌中占0.7%～28％
在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响,其中 关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率 高,易于提取RNA。 很显然在许多酵母中,早期细胞中的RNA含量高, 其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。 (2)高RNA含量酵母菌株的筛选可以从自然界筛选 到RNA含量高的酵母菌株,也可用诱变育种的方法 提高酵母菌的RNA含量
在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中 关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率 高，易于提取RNA。 很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高， 其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。 （2）高RNA含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选 到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法 提高酵母菌的RNA含量
稀碱法:是用氢氧化钠溶液(1%),使细胞壁变 性,使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和PH7。然 后除去菌体,将pH调至RNA的等电点(pH25,使 RNA沉淀出来。上法的缺点是制得的RNAM较 低、磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA,90℃保持 3-4h破坏酶)。 浓盐法:是用高浓度盐溶液(6%8%)处理,同 时加热,以改变细胞壁的通透性,使核酸从细胞内 释放出来 要避免分子降解,可采用苯酚法制备RNA。用苯 酚处理生物材料,使蛋白质变性,然后离心,上层水 溶液内含有全部RNA,可用乙醇沉淀出来
稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变 性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和PH7。然 后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使 RNA沉淀出来。上法的缺点是制得的RNA Mr较 低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90 ℃保持 3~4h破坏酶)。 浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%~8%）处理，同 时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内 释放出来。 要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯 酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水 溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来
脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1moML,不溶于 0.14mo,而核糖核蛋白溶于0.14mo/L盐溶液 (4)RNA的提取实例:啤酒酵母是提取RNA的 很好的资源。取100g压榨啤酒酵母(含水份 70%),加入230m含NaOH3g的水,20℃以下缓 慢搅拌30分钟。用6mol/LHCl调至pH7,搅拌15 分钟,离心得清液255n1。冷至10℃以下,6mol /LHCl调pH25,置冷过夜,离心得RNA18g (纯度80%)
脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,不溶于 0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。 （4）RNA的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的 很好的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份 70%），加入230ml含NaOH 3g的水，20℃以下缓 慢搅拌30分钟。用6mol／L HCl调至pH7，搅拌15 分钟，离心得清液255m1。冷至10℃以下，6mol ／L HCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNA l.8g （纯度80％）
二)DNA的提取与制备 1.工业用DNA的提取 取新鲜冷冻鱼精20kg,用绞肉机粉碎2次成浆状, 加入等体积水,搅拌均匀,倾入反应锅内,缓慢搅拌, 升温至100℃,保温15分钟,迅速冷却至20~25℃, 离心除去鱼精蛋白等沉淀物,获得35L含热变性DNA 的溶液,经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解 生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA,在热变性 DNA溶液中逐渐加入等体积95%乙醇,离心可获得纤 维状DNA,沉淀用乙醇、丙酮洗涤,减压低温干燥得 DNA粗品,产品含热变性DNA50%~60%
（二）DNA的提取与制备 1．工业用DNA的提取 取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状， 加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌， 升温至100℃，保温15分钟，迅速冷却至20～25℃， 离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA 的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解 生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA，在热变性 DNA溶液中逐渐加入等体积95％乙醇，离心可获得纤 维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得 DNA粗品，产品含热变性DNA50％～60％
2、具有生物活性DNA的制备 动物内脏(肝、脾、胸腺)加4倍重量生理盐水 经组织捣碎机捣碎1分钟,匀浆于2500/pm离心30分 钟,沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次,每次洗后 离心,将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中,再捣 碎3分钟,加入2倍量5%的(用45%乙醇作溶剂)十 二烷基磺酸钠,并搅拌2~3小时,在0℃250/pm离 心,在上层液中加入等体积的冷95%乙醇,离心即可 得到纤维状DNA,再用冷乙醇和丙酮洗涤,减压低温 干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水,加入5 6十二烷基磺酸钠达1/10体积,搅拌1小时,经 5000r/pm离心1小时,清液中加入NaC达1mol/L, 再缓慢加入冷95%乙醇,DNA析出,经乙醇、丙酮洗 涤,真空干燥得具有生物活性的DNA(活性DNA制 备需在0~3℃操作)
2、具有生物活性DNA的制备 动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水 经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500r／pm离心30分 钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗后 离心，将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，再捣 碎3分钟，加入2倍量5％的（用45%乙醇作溶剂）十 二烷基磺酸钠，并搅拌2～3小时，在0℃2500r／pm离 心，在上层液中加入等体积的冷95％乙醇，离心即可 得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温 干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5 ％十二烷基磺酸钠达1／10体积，搅拌1小时，经 5000r／pm离心1小时，清液中加入NaCl达1mol／L， 再缓慢加入冷95%乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗 涤，真空干燥得具有生物活性的DNA（活性DNA制 备需在0～3℃操作）
用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 (一)酶解法及碱水解法制备核苷酸 1、酶解法制备脱氧核苷酸 桔青霉产生5-磷酸二脂酶 红酵母产生3-磷酸二脂酶
二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 （一）酶解法及碱水解法制备核苷酸 1、酶解法制备脱氧核苷酸 桔青霉产生5`-磷酸二脂酶 红酵母产生3`-磷酸二脂酶
桔青霉或熄曲霉 鱼精 液体培养跌 绞肉机粉碎 发酵液 鱼精匀浆 压滤除菌体 热变性 冷却,过滤 混和,调pH 酶液 DNA溶液 保温 ){.::s 酶解液 加热使酶失活,调pH9.0 量冷处过夜;过滤 DNA降解液 吸附于氯型阴离子交换树 脂分步洗脱 脱氧胞苷酸 脱氧腺苷酸 脱氧胸苷酸 脱氧鸟苷酸 :,:(MP '(dAMP),' (dIMP) (MP)
2、酶解法制备戊糖核苷酸 我国从60年代开始使用核酸酶P降解核糖核酸生产 单核苷酸,日本年产呈味核苷酸(肌苷酸和鸟苷酸) 3000吨,其中60%是使用酶解法生产的。 酶解法生产5“—单核苷酸工艺流程
2、酶解法制备戊糖核苷酸 我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产 单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸） 3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。 酶解法生产5‘—单核苷酸工艺流程
桔育霉M843培养 酵母提取 产生核酸薛P RNA RNA降解成 5—单核苷酸 元寓水厘舱 阳高子 魔出液pH,5 pH2.0~3.5 pH3.5~4.0 H3.5~4.5 UMP混浊液 GMP. CMP CMP AMP 混合液 稀溶液 稀溶液 碳柱吸附, 阴离子树脂 解吸 分离 CMP 减压 除盐等杂质 pH4流出液 溶液 阴高子树 浓缩 UMP 3%NaC1洗脱 脂浓缩 阴高子树脂分离「GMP GMP AMP 纯化 浓溶液 浓溶液 浓液 UMP 稀溶液 酒精沉淀, 酒特沉 酒精抗 浓缩 干燥 淀,干燥 淀于燥 酒精沉淀 UMP GMP MP 干粉 干粉 干粉 干粉