双缩脲法 测定血清蛋白质含量 生物化学与分子生物学教研室
双缩脲法 测定血清蛋白质含量 生物化学与分子生物学教研室
引言蛋白质的定量分析 1)某类或某种蛋白质的含量 2)样品总蛋白含量 ①重复的肽链结构；如双缩脲法、BCA法； ②芳香族氨基酸的特殊性质；如酚试剂法和紫 外分光光度法； ③与色素的结合能力；如考马斯亮蓝法； ④沉淀后借浊度或光折射测定，如比浊法、折 光测定法等
引言 蛋白质的定量分析 ① 重复的肽链结构；如双缩脲法、BCA法； ② 芳香族氨基酸的特殊性质；如酚试剂法和紫 外分光光度法； ③与色素的结合能力；如考马斯亮蓝法； ④ 沉淀后借浊度或光折射测定，如比浊法、折 光测定法等。 1) 某类或某种蛋白质的含量 2）样品总蛋白含量
实验目的 二 实验原理 三 实验材料与仪器（详见教材） 四 实验步骤 五注意事项 六思考题
一 实验目的 二 实验原理 三 实验材料与仪器（详见教材） 四 实验步骤 五 注意事项 六 思考题
实验目的 ☑了解蛋白质含量测定的方法。 ☑掌握双缩脲法测定蛋白质的原理和方法 ☑掌握分光光度计的使用
Ø 了解蛋白质含量测定的方法。 Ø 掌握双缩脲法测定蛋白质的原理和方法 Ø 掌握分光光度计的使用 一 实验目的
二、 实验原理 l.双缩脲及双缩脲反应（Biuret reaction) 两分子脲（尿素）加热脱氨缩合成双缩脲，因分子内含 有两个邻接的酰胺键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲 反应，生成紫红色络合物。 NH2 O-G NH2 NH2 NH2 NH135190℃0=C Cu2+ NH NH NH2 △ OH O=0 -Cu24 O=G NH2 NHs t NH2 NH2 H2N 尿素 双缩脲 紫红色络合物 [A]
1.双缩脲及双缩脲反应（Biuret reaction） 两分子脲（尿素）加热脱氨缩合成双缩脲，因分子内含 有两个邻接的酰胺键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲 反应，生成紫红色络合物。 二、实验原理
2.蛋白质的双缩脲反应 蛋白质分子含有大量与双缩脲 (Poly peptide chains) R R R 0 结构相似连的肽键（-CO-NH-) 同样可以发生双缩脲反应生成紫 红色的Cu2+-蛋白质络合物。且在 一定范围内紫色的深浅与蛋白质 含量成正比！因此可以用分光光 度法测定样品中蛋白质含量。 Cu2+-蛋白质络合物
2. 蛋白质的双缩脲反应 蛋白质分子含有大量与双缩脲 结构相似连的肽键（-CO-NH-）， 同样可以发生双缩脲反应生成紫 红色的Cu2+-蛋白质络合物。且在 一定范围内紫色的深浅与蛋白质 含量成正比！因此可以用分光光 度法测定样品中蛋白质含量。 Cu2+-蛋白质络合物
三、 实验材料与仪器 1.器材 (1)V-5000型可见分光光度计 （2)玻璃仪器（试管、刻度吸管)；移液枪；移液器， （3)坐标纸 2.试剂 (1)6 mol/L NaOH (2)双缩脲试剂：称取CuS045H202.5g,酒石酸钾10.0g和 碘化钾5.0g,分别溶解后混匀，加5mol/儿NaOH I00ml,最后加 水定容至1000ml,贮于棕色瓶中避光保存，若瓶中有暗红色沉淀出 现，则需要重新配制。 (3)9 g/L NaCl (4)蛋白质标准液(10g/L） (5)待测血清样本健康人血清稀释10倍！
三、实验材料与仪器 1. 器材 （1）V-5000型可见分光光度计 （2）玻璃仪器（试管、刻度吸管）；移液枪；移液器； （3）坐标纸 2. 试剂 （1）6 mol/L NaOH （2）双缩脲试剂：称取CuS04 ·5H2O 2.5g，酒石酸钾10.0 g和 碘化钾5.0g，分别溶解后混匀，加5 mol/L NaOH l00ml，最后加 水定容至1000ml，贮于棕色瓶中避光保存，若瓶中有暗红色沉淀出 现，则需要重新配制。 （3）9 g/L NaCl (4) 蛋白质标准液（10g/L） （5）待测血清样本 健康人血清稀释10倍！
四、实验步骤 1加样。取试管7支，按下表操作并记录： 空白 标准管 管 3 测定管 蛋白质标准液 (10g/L)(ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 待测血清样本 (已稀释10倍) (ml) 9g/L NaCli溶液 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 (ml) 双缩脲试剂(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 浓度(g/L) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 ? 光吸收值 0 A A2 A3 As A A 混匀各管，室温放置30分钟。以空白管调零，在波长540nm比色， 读取各管光吸收值A1.5和At,并记录
1.加样。 取试管7支，按下表操作并记录： 空白 管 标准管 测定管 1 2 3 4 5 蛋白质标准液 （10g/L）(ml) — 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 — 待测血清样本 （已稀释10倍） (ml) — — — — — — 1 9g/L NaCl溶液 (ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 — 0 双缩脲试剂(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 浓度（g/L) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 ? 混匀各管，室温放置30分钟。以空白管调零，在波长540 nm比色， 读取各管光吸收值A1 -5和At ，并记录。 四、实验步骤 光吸收值 0 A1 A2 A3 A4 A5 At
2.计算血清蛋白质浓度 室温：25 (1)标准曲线法 分光光度计：V-5000可见光分光光度计 (sh-003) 波长：540nm 0 在坐标纸上，以蛋白质浓度 A540 日期：2021-06-01 为横坐标，以光吸收值为纵 0.7 光0.6 坐标，绘制标准曲线。 吸A 0 以测定管的光吸收值A在 0.4 值 0.3 标准曲线上查出该待测血清 0.2 0.1 稀释样本的蛋白质浓度Ct。 0.40.81.2ct1.62c(g/) 根据稀释倍数计算血清蛋白 蛋白浓度 双缩脲法测定血清蛋白质含量的浓度-吸光度标准曲 质的浓度(g/八)。 线 血清蛋白质浓度=Ct×50
(1) 标准曲线法 Ø 在坐标纸上，以蛋白质浓度 为横坐标，以光吸收值为纵 坐标，绘制标准曲线。 Ø 以测定管的光吸收值At在 标准曲线上查出该待测血清 稀释样本的蛋白质浓度Ct。 Ø 根据稀释倍数计算血清蛋白 质的浓度（g/L）。 血清蛋白质浓度=Ct x 50 2. 计算血清蛋白质浓度 At Ct 室温：25 分光光度计：V-5000可见光分光光度计 （sh-003） 波长：540nm 日期：2021-06-01 双缩脲法测定血清蛋白质含量的浓度-吸光度标准曲 线
2.计算血清蛋白质浓度 (2)标准管法（标准对照法) (从标准管中选择一管光吸收值测定管最接近者，用计算方 法求出待测血清中蛋白质的浓度) A标=K标C标L标 A测=K测C测L测 C测=A测/A标XC标 C血清蛋白质=℃测ⅹ稀释倍数
(2)标准管法（标准对照法） （从标准管中选择一管光吸收值测定管最接近者，用计算方 法求出待测血清中蛋白质的浓度） 2. 计算血清蛋白质浓度 A标 =K标 C标 L标 A测 =K测 C测 L测 C血清蛋白质 =C测 x 稀释倍数 C测 =A测 /A标 ×C标