●000●00● 高效液相色谱法测定食品中的 防腐剂和甜味剂 High performance liquid chromatography 复旦大学化学教学实验中心 雷杰 Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心
成人与继续教育学院 职 业 教 育 学 院 Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心 博博 学学 而而 笃笃 志志 切切 问问 而而 近近 思思 高效液相色谱法测定食品中的 防腐剂和甜味剂 High performance liquid chromatography 复旦大学 化学教学实验中心 雷 杰
●000●00● 内容提要 °高效液相色谱法(HPLC的特点 高效液相色谱法的主要类型和原理 高效液相色谱仪 色谱柱简介 色谱理论基础 实验内容 Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心
成人与继续教育学院 职 业 教 育 学 院 Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心 博博 学学 而而 笃笃 志志 切切 问问 而而 近近 思思 内容提要 • 高效液相色谱法(HPLC)的特点 • 高效液相色谱法的主要类型和原理 • 高效液相色谱仪 • 色谱柱简介 • 色谱理论基础 • 实验内容
、高效液相色谱法(HPLC的特点●● 历史回顾 固定相、流动相;气相、液相。 1906-Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919) 碳酸钙吸附剂 石油醚 ■1940s-分配色谱和纸色谱 1950s-气相,薄层,凝胶过滤色谱 梯度洗脱色谱 ■1960s-商业高效液相色谱. 柱色诺分离原理 M.S. Tswett. Ber. Dtsch. Bot. Ges. 24: 384-393(1906) Experimental Center for Chemical education, FDU 积区达:化学数学实验冲公
成人与继续教育学院 职 业 教 育 学 院 Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心 博博 学学 而而 笃笃 志志 切切 问问 而而 近近 思思 历史回顾 M.S. Tswett. Ber. Dtsch. Bot. Ges. 24: 384-393 (1906) 1906 - Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919) 碳酸钙吸附剂 石油醚 1940‘s - 分配色谱和纸色谱 1950‘s - 气相, 薄层，凝胶过滤色谱 梯度洗脱色谱 1960‘s - 商业高效液相色谱. 一、高效液相色谱法(HPLC)的特点 固定相、流动相；气相、液相
●000●00● FDU 化学教学实验中心
成人与继续教育学院 职 业 教 育 学 院 Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心 博博 学学 而而 笃笃 志志 切切 问问 而而 近近 思思
●000●00● 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上, 引用了气相色谱的理论;在技术上,流动相改为高 压输送;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填 充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米 塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏 度的检测器,可对流出物进行连续检测。高压液相 色谱的特点有: Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心
成人与继续教育学院 职 业 教 育 学 院 Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心 博博 学学 而而 笃笃 志志 切切 问问 而而 近近 思思 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上， 引用了气相色谱的理论；在技术上，流动相改为高 压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填 充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米 塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏 度的检测器，可对流出物进行连续检测。高压液相 色谱的特点有：
●000●00● 1.高压:液体流经色谱柱,受到阻力较大,为了迅速地通过色谱柱,必须对流动 相施加高压 2.高速:流动相在柱内的流速较经典色谱快得多,一般可达1~10m/min。高效 液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多,一般少于1h 3.高效:颗粒极细(一般为10μm以下)、规则均匀的固定相,传质阻抗小,柱 效高,分离效率高 4.高灵敏度:高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器,进一步提高了分析的 灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达1011g。另外,用样量小,一般几个微升。 5.适应范围宽:气相色谱法虽具有分离能力好,灵敏度高,分析速度快,操作方 便等优点,但是受技术条件的限制,沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于 应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法,只要求试样能制成溶液,而不需 要气化,因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大 (大于400以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的75%~80%)原则 上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计,在已知化合物中,能用 气相色谱分析的约占20%,而能用液相色谱分析的约占70~80%。 Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心
成人与继续教育学院 职 业 教 育 学 院 Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心 博博 学学 而而 笃笃 志志 切切 问问 而而 近近 思思 1. 高压：液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对流动 相施加高压。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效 液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。 3. 高效：颗粒极细（一般为10 mm以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱 效高，分离效率高。 4. 高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的 灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5. 适应范围宽：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方 便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于 应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需 要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大 （大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则 上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用 气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%
高效液相色谱法的主要类型和原理●● )主要类型 分配色谱法( partition chromatography) 吸附色谱法( adsorption chromatography) >离子交换色谱法(IEC) 空间排阻色谱法(SEC) 化学键合相色谱法( bonded phase chromatography;BPC) >亲合色谱法( affinity chromatography;AC) 手性色谱法( chiral chromatography;CC) >胶束色谱法( micellar chromatography;MC) >电色谱法( electrochromatography;EC) Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心
成人与继续教育学院 职 业 教 育 学 院 Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心 二、高效液相色谱法的主要类型和原理 博博 学学 而而 笃笃 志志 切切 问问 而而 近近 思思 （一）主要类型 ➢分配色谱法（partition chromatography） ➢吸附色谱法（adsorption chromatography） ➢离子交换色谱法（IEC） ➢空间排阻色谱法（SEC） ➢化学键合相色谱法(bonded phase chromatography；BPC) ➢亲合色谱法（affinity chromatography；AC） ➢手性色谱法（chiral chromatography；CC） ➢胶束色谱法（micellar chromatography；MC） ➢电色谱法（electrochromatography；EC）
●000●00● (二)化学键合相色谱法 通过特定的液态物质涂于担体表面,或化学键合于担体表面,现在多采用 的是化学键合固定相,如c18、c8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 以化学键合相为固定相的色谱法,简称键合相色谱法。 化学键合相:采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相。 优点 (1)固定相的均一性和稳定性好,在使用过程中不易流失,使用周期长; (2)柱效高;重现性好; (3)能使用的流动相和键合相的种类多,分离的选择性高 根据化学键合相与流动相极性的相对强弱 正相( normal phase,NP)和反相( reversed phase,RP)键合相色谱法: Experimental Center for Chemical education, FDU 积区达:化学数学实验冲公
成人与继续教育学院 职 业 教 育 学 院 Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心 博博 学学 而而 笃笃 志志 切切 问问 而而 近近 思思 （二）化学键合相色谱法 • 以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法。 • 化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相。 优点： （1）固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不易流失，使用周期长； （2）柱效高；重现性好； （3）能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高 根据化学键合相与流动相极性的相对强弱 正相（normal phase，NP）和反相（reversed phase，RP）键合相色谱法： 通过特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面，现在多采用 的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱
A(E)反相键合相色谱法 Typical Silica C18 固定相:非极性键合相 ODS 如十八烷基硅烷(C18,ODs)、辛烷 基(c3)键合硅胶 流动相:水为基础溶剂,加入一定量与 水混溶的极性调整剂 CHICHCI CHCH-CH: CH CH-CH HCH-CHs 常用甲醇-水、乙腈水体系等 应用:广。非极性至中等极性的组分,(还有有机酸、碱及盐等) Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心
成人与继续教育学院 职 业 教 育 学 院 Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心 博博 学学 而而 笃笃 志志 切切 问问 而而 近近 思思 （三）反相键合相色谱法 • 固定相：非极性键合相 – 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷 基（C8）键合硅胶 • 流动相：水为基础溶剂，加入一定量与 水混溶的极性调整剂 – 常用甲醇-水、乙腈-水体系等 • 应用：广。非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、碱及盐等）
●000●00● 保留行为的主要影响因素 1、溶质的分子结构(极性) 极性越弱,疏水性越强,k越大,也越大。 同系物碳数越多,极性越弱,k越大; 引入极性取代基,降低疏水性,κ值变小。 2、固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加,溶质的κ也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大,则溶质的k越大。 Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心
成人与继续教育学院 职 业 教 育 学 院 Experimental Center for Chemical education, FDU 化学教学实验中心 博博 学学 而而 笃笃 志志 切切 问问 而而 近近 思思 • 保留行为的主要影响因素 1、溶质的分子结构（极性） 极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。 2、固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大