四、基因的分离与鉴定 一般而言,一个基因→是编码一条多肽链的一个DNA 片段,包括启动子、终止子及内含子等。 在DNA重组技术出现之前,由于DNA 分子量大而结构单一,DNA是细胞中最难 分析的大分子。 DNA重组技术发展成功之后,DNA已 成为细胞中最易操作分析的大分子
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DNA的体外重组: 1体外通过限制性内切酶二m 的修剪和DNA连接酶的 连接; 2目标DNA分子+载体 DNA,共价连接; P获得重组DNA分子 m 2/95
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、从基因库中分离基因: 1.基因库( library) 是一组DNA和cDNA序 列克隆的集合体,从基因库999999 中分离基因,首先要构建 t 基因库。 根据克隆核酸序列、来 源,基因库可分为: 核基因库、染色体库、 cDNA库、线粒体库等。 构建基因文库 3/95
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①.核基因库: 核基因库 genomic library):将某生物全部基因组DNA 酶切后与载体连接构建而成。 构建文库可采用不同的载体: 质粒载体:重组质粒导入感受态细胞啼收集菌落。 噬菌体或柯斯质粒( cosmid载体:将重组DNA包装进 噬菌体感染细菌啼收集噬菌斑 BAC(细菌人工染色体或YAC酵母人工染色体)体: 重组人工染色体中导入宿主细胞啼收集细胞。 4/95
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②.染色体基因库: 将染色体用来构建基因库啼可选择特异基因和分析 染色体结构和组织。 如果蝇的多线 染色体:对染色体 进行微切割,可以 构建染色体区段的 基因文库。 5195
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人类基因组项目研究中,利用流动细胞分离(ow cytometry)技术将人类染色体分开构建单个染色体基因库 加速人类基因组作图和分析。 分离染色体进行 验证 45 0,13 流式细胞分离原理丿 6/95
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酵母菌: 利用改良的脉冲电泳方法 pulsed field gel electro phoresis,FGE),将酵母菌16根染色体依据其分子量 大小分开后,用于构建染色体库,在基因组的分析中 发挥作用。 酵母菌 7195
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③.cDN4: p RNA为模板→反转录酶4 11 合成互补DNA→构建基因库 真核生物mRNA3端有一段 2开始合成DNA 多聚A尾端→双链DNA分子经 ↓3 CDNA-RNA杂合双链 两端补齐→以带限制性酶切点 4cDNA3发夹结构 的人工接头连接+酶切后与载 台成第二链 体(通常是噬菌体连接→制备 DNA库。 双链CDNA DNA库与核DNA库不同: M会成示象图 cDNA库仅具有细胞或组织 poy7引物和冷我m分子复性:2在T引 导下开始形歧互和剂]3完整一每(N合 内表达基因的mRNA序列→仅包 威,那成心O合创:4CN描左3难围发 吴构三发盐构们导会成二用Rwe理 括基因组的部分基因序列。 6将单统降解,得到双M 8/95
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2.筛选基因库: 根据待选基因相关信息→确定筛选方法和条件 今从基因库中筛选、分离基因。 多数方法是利用一段核苷酸序列①NA、cDNA或 寡聚核苷酸)或抗体作探针( Probe,用放射性同位素或 非放射性同位素标记探针→筛选基因库。 9195
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筛库过程: M treelawn 将噬菌体感染形成的噬菌 L 斑印影在硝酸纤维膜上变性→ 带有目的基因的放射性DN或m DNA作探针进行杂交放射性 自显影→杂交信号(黑点)对 应的噬菌斑即为阳性克隆。 10/95
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