D0I:10.13374/i.issnl00103.2007.s2.082 第29卷增刊2 北京科技大学学报 Vol.29 Suppl.2 2007年12月 Journal of University of Science and Technology Beijing Dee.2007 产絮凝剂双菌复合发酵体系的研究 以及在水处理中的应用 林海郝洁侯瑞荣张世勇 北京科技大学土木与环境工程学院，北京100083 摘要从土壤和活性污泥中筛选到三株絮凝剂产生菌，将其进行双菌混合培养的正交试验，构建出了比单一菌所产絮凝剂 絮凝活性更高的复合菌群LH,通过16 SrRNA序列分析，初步判定二菌分别为Mierococeus s即·和Paenibacillus velaei菌.对其 性质的初步研究发现，复合菌LH所产絮凝剂MBF-LH为胞外代谢产物，其热稳定性好.LH产絮凝剂的最适碳源、最适培养 温度、最适pH值和通气量分别为蔗糖、30℃、pH8和120r/min恒温振荡培养.培养基中添加KCl,CaS04、K2HP04能明显提 高发酵液絮凝率.絮凝剂MBF-LH处理废水时具有用量少、絮凝率高的特点， 关键词微生物絮凝剂：复合菌群：16 SrRNA;培养条件优化 分类号X172 絮凝剂是一种使液体中不易沉降的固体悬浮颗 本试验共用到四种筛选培养基6：(1)牛肉膏、 粒凝聚沉降的物质，被广泛应用于化工、矿业、环保 蛋白胨基础培养基；(2)通用发酵培养基；(3)查氏培 等领域]，传统絮凝剂由于其高絮凝活性和低费 养基；(4)高氏一号培养基 用已经被广泛使用，但它含有毒害神经和致癌的单 1.2.2培养条件 体，因而使用受到限制山.因此研制高效、无毒的絮 种子培养：于新鲜斜面上取一环菌，接至装有 凝剂是目前环境工程领域中的重要内容，微生物絮 100mL种子培养基的250mL三角瓶中，在30℃、 凝剂(Microbial Flocculants,简称MBF)就是具有这 120r/min摇床转速下培养24h. 些优点的一种新型絮凝剂，它属于天然高分子有机 摇瓶培养：在250mL的三角瓶中装入100mL 物（生物树脂），是人们近年来利用生物技术开发出 培养基，灭菌后，按1%的接种量将菌种自种子培养 的一类由微生物在特定培养条件下生长代谢至一定 基中接入，在30℃、120r/min摇床转速下培养72h, 阶段产生的具有絮凝活性的物质，可使水体中不易 以发酵液的絮凝活性作为絮凝菌株筛选标准 降解的固体悬浮颗粒、菌体细胞及胶体粒子等凝集、 1.3测定方法 沉淀的特殊高分子聚合物.我国在MBF方面研究 起步晚，一般采用从絮凝剂将被应用的目的环境中 1.3.1菌生长量以660m处的光密度值0D660表 筛选出单一菌株，测定其絮凝性能，但单株微生物发 示01 酵存在目标产物转化效率低，培养条件要求严格和 1.3.2絮凝活性测定方法8] 对环境因素适应性差等缺陷，解决这一难题的有效 取100mL1g/L的高岭土（高岭土配置前过 途径是研究复合微生物产絮凝剂来代替单菌产絮凝 160目筛)悬液于150mL烧杯中，调节高岭土悬浊 剂. 液的pH值为7.0，用电磁搅拌器在快速搅拌(250 r/min)过程中依次加入2 mL CaCl2溶液（质量百分 1材料与方法 比浓度=1%)、2mL发酵液，接着快搅(250r/min) 1.1样品采集 lmin,再慢搅(60r/min)3min后，静置4min,取2 从北京城市排水集团高碑店污水处理厂采集土 cm处上清液，用722型分光光度计测定吸光度 样以及曝气池的活性污泥 0D550,同时以相应不接菌的空白培养基代替发酵液 1.2培养基与培养条件 作对照，以絮凝率表示絮凝活性，按下列公式计算絮 1.2.1培养基 凝率E, 收稿日期：2007-10-15 E=(A0-A)/A0X100% 作者简介：林海(1966一)男，教授，博士生导师 式中E为絮凝率；Ao为对照上清液550nm处的吸
产絮凝剂双菌复合发酵体系的研究 以及在水处理中的应用 林 海 郝 洁 侯瑞荣 张世勇 北京科技大学 土木与环境工程学院北京100083 摘 要 从土壤和活性污泥中筛选到三株絮凝剂产生菌将其进行双菌混合培养的正交试验构建出了比单一菌所产絮凝剂 絮凝活性更高的复合菌群 LH通过16SrRNA 序列分析初步判定二菌分别为 Micrococcus sp．和 Paenibacillus velaei 菌．对其 性质的初步研究发现复合菌 LH 所产絮凝剂 MBF－LH 为胞外代谢产物其热稳定性好．LH 产絮凝剂的最适碳源、最适培养 温度、最适 pH 值和通气量分别为蔗糖、30℃、pH8和120r／min 恒温振荡培养．培养基中添加 KCl、CaSO4、K2HPO4 能明显提 高发酵液絮凝率．絮凝剂 MBF－LH 处理废水时具有用量少、絮凝率高的特点． 关键词 微生物絮凝剂；复合菌群；16S rRNA；培养条件优化 分类号 X172 收稿日期：2007-10-15 作者简介：林 海（1966－）男教授博士生导师 絮凝剂是一种使液体中不易沉降的固体悬浮颗 粒凝聚沉降的物质被广泛应用于化工、矿业、环保 等领域［1－3］．传统絮凝剂由于其高絮凝活性和低费 用已经被广泛使用但它含有毒害神经和致癌的单 体因而使用受到限制［4］．因此研制高效、无毒的絮 凝剂是目前环境工程领域中的重要内容微生物絮 凝剂（Microbial Flocculants简称 MBF）就是具有这 些优点的一种新型絮凝剂它属于天然高分子有机 物（生物树脂）是人们近年来利用生物技术开发出 的一类由微生物在特定培养条件下生长代谢至一定 阶段产生的具有絮凝活性的物质可使水体中不易 降解的固体悬浮颗粒、菌体细胞及胶体粒子等凝集、 沉淀的特殊高分子聚合物．我国在 MBF 方面研究 起步晚一般采用从絮凝剂将被应用的目的环境中 筛选出单一菌株测定其絮凝性能但单株微生物发 酵存在目标产物转化效率低培养条件要求严格和 对环境因素适应性差等缺陷解决这一难题的有效 途径是研究复合微生物产絮凝剂来代替单菌产絮凝 剂［5］． 1 材料与方法 1∙1 样品采集 从北京城市排水集团高碑店污水处理厂采集土 样以及曝气池的活性污泥． 1∙2 培养基与培养条件 1∙2∙1 培养基 本试验共用到四种筛选培养基［6］：（1）牛肉膏、 蛋白胨基础培养基；（2）通用发酵培养基；（3）查氏培 养基；（4）高氏一号培养基． 1∙2∙2 培养条件 种子培养：于新鲜斜面上取一环菌接至装有 100mL 种子培养基的250mL 三角瓶中在30℃、 120r／min 摇床转速下培养24h． 摇瓶培养：在250mL 的三角瓶中装入100mL 培养基灭菌后按1％的接种量将菌种自种子培养 基中接入在30℃、120r／min 摇床转速下培养72h 以发酵液的絮凝活性作为絮凝菌株筛选标准． 1∙3 测定方法 1∙3∙1 菌生长量以660nm 处的光密度值 OD660表 示［7］ 1∙3∙2 絮凝活性测定方法［8］ 取100mL 1g／L 的高岭土（高岭土配置前过 160目筛）悬液于150mL 烧杯中调节高岭土悬浊 液的 pH 值为7∙0用电磁搅拌器在快速搅拌（250 r／min）过程中依次加入2mL CaCl2溶液（质量百分 比浓度＝1％）、2mL 发酵液接着快搅（250r／min） 1min再慢搅（60r／min）3min 后静置4min取2 cm 处上清液用722型分光光度计测定吸光度 OD550同时以相应不接菌的空白培养基代替发酵液 作对照以絮凝率表示絮凝活性按下列公式计算絮 凝率 E． E＝（ A0－ A）／A0×100％ 式中 E 为絮凝率；A0 为对照上清液550nm 处的吸 第29卷 增刊2 2007年 12月 北 京 科 技 大 学 学 报 Journal of University of Science and Technology Beijing Vol．29Suppl．2 Dec．2007 DOI:10．13374／j．issn1001－053x．2007．s2．082
Vol.29 Suppl.2 林海等：产絮凝剂双菌复合发酵体系的研究以及在水处理中的应用 .31. 光度；A为絮凝后上清液550nm处的吸光度 PCR产物切胶后用胶回收试剂盒（赛百盛生物 1.4菌种筛选 有限公司)回收，回收产物进行PCR产物直接测序 1.4.1菌种初筛 所得l6 SrDNA序列，通过Blast与Genebank数据库 在大试管中装入20mL1g/L的高岭土悬浮液， 进行比较 向其中加入400菌液，静置5min.用肉眼观测其 1.6絮凝活性分布 是否有絮凝现象，以不加菌液的高岭土悬浮液为空 取10mL的发酵液，在5000r/min的转速下离 白样品，比较上清液浊度，同时观察絮凝效果（包括 心分离，得上清液及底部浓度较大的两部分，底部 絮凝体形成情况、絮体大小、絮凝速度)，将具有良好 浓度较大的部分中加生理盐水，在5000r/min的转 絮凝活性的菌株作为复筛菌种. 速下离心分离两次，倒掉上清液，底部沉淀物即为絮 1.4.2菌种复筛 凝剂产生菌，将沉淀物中加入10mL生理盐水制成 将初筛得到的菌株按1.2节的方法培养，1.3.2 细胞悬浊液，分别测定发酵原液、上清液以及细胞 节的方法所得的结果作为复筛指标. 悬浊液的絮凝活性， 1.4.3双菌混合培养的正交试验 1.7热稳定性试验 将复筛得到的絮凝菌进行双菌(1：1)混合培养 将离心去除菌体的培养液置于高压锅中在 的正交试验，采用复筛相同的方法进行培养，根 121℃灭菌20min,之后按1.3.2节的方法测定其絮 据最终发酵液的絮凝效果构建最佳的絮凝菌群， 凝活性， 1.516 S rRNA基因的PCR扩增及序列测定 1.8培养条件对菌体生长及絮凝剂产生的影响 1.5.1DNA的抽提 对筛选出来的混合菌，分别改变培养条件，如培 细菌总DNA的抽提使用Omga细菌总DNA抽 养基的成分及初始pH值、培养温度、摇床转速等因 提试剂盒， 素，测定发酵液的絮凝活性，以确定混合双菌产絮凝 1.5.2引物 剂的最优条件 根据文献报道设计引物0]，由北京优博基因科 1.9絮凝剂粗品提取 技有限公司合成，序列如下 将发酵液置于冷冻离心机中，10000r/min,离 上游引物P1:5'一CGggatccAGAGTTTGAT- 心l0min,留取上清液，弃去菌体.将3倍无水冷乙 CCTGGCTCAGAACGAACGCT-3'. 醇加入上清液中，沉淀絮凝物质，取絮凝剂沉淀 下游引物P6:5一CGggatccTACGGCT ACC- 4000r/min,离心10min,弃去上清，将沉淀部分真 TTGTTACGACTCACCCC-3. 空干燥，得絮凝剂粗品[ 其中小写字母为BamH I酶切位点，其上下游 序列分别对应于E,coi16 SrRNA基因的第8~37 2结果与讨论 个碱基位置和第1479~1506个碱基位置. 2.1絮凝菌株筛选结果 1.5.3反应体系 本试验初筛共分离出絮凝产生菌13株，复筛后 参考《PCR技术实验指南》中PCR的设计原 发现其中3株L2、L5和L9具有较强转化效率，其絮 则，综合考虑各个因子的影响水平，设计采用20L 凝率分别为42.1%、56.7%，63%. 体系：模板DNA1L,引物各1L,dNTPs1L,Tap 在实验中发现，细菌L2在牛肉膏蛋白胨培养基 酶0.3L,10 PCR buffer2L,加dH20补足至20 上生长旺盛，但只能在查氏培养液中产生絮凝剂，不 L 过该培养液不利于其菌体生长；细菌L5只能在查氏 1.5.4退火温度 中生长并产生絮凝剂，在其余三种培养基上几乎不 以引物的理论退火温度T=58℃为基准，在附 生长，也不产絮凝剂：霉菌Lg可在通用发酵培养液、 件设计梯度实验验证，选取最佳退火温度 查氏培养液和高氏一号培养液中产生絮凝剂，其中 Ta=53℃ 以查氏培养液中产生的絮凝剂较好，综上所述，本 1.5.5PCR参数 试验选定查氏培养基为后续试验用培养基， PCR参数：95℃预变性4min→在94℃保持 2.2双菌混合培养的正交试验 45s→在53℃保持45s→在72℃保持30s→30个循 将3株絮凝菌株按照1：1接种进行混合培养， 环→最终在72℃延伸1.5min. 发现L2和L5菌株组合所得发酵液絮凝效果优于其 1.5.6回收测序和分析 他各组，同时也优于各个单菌培养液及各单菌培养
光度；A 为絮凝后上清液550nm 处的吸光度． 1∙4 菌种筛选 1∙4∙1 菌种初筛 在大试管中装入20mL1g／L 的高岭土悬浮液 向其中加入400μL 菌液静置5min．用肉眼观测其 是否有絮凝现象以不加菌液的高岭土悬浮液为空 白样品比较上清液浊度同时观察絮凝效果（包括 絮凝体形成情况、絮体大小、絮凝速度）将具有良好 絮凝活性的菌株作为复筛菌种． 1∙4∙2 菌种复筛 将初筛得到的菌株按1∙2节的方法培养1∙3∙2 节的方法所得的结果作为复筛指标． 1∙4∙3 双菌混合培养的正交试验 将复筛得到的絮凝菌进行双菌（1∶1）混合培养 的正交试验［9］采用复筛相同的方法进行培养．根 据最终发酵液的絮凝效果构建最佳的絮凝菌群． 1∙5 16S rRNA 基因的 PCR 扩增及序列测定 1∙5∙1 DNA 的抽提 细菌总 DNA 的抽提使用 Omga 细菌总 DNA 抽 提试剂盒． 1∙5∙2 引物 根据文献报道设计引物［10］由北京优博基因科 技有限公司合成序列如下． 上游 引 物 P1：5′－CGggatccAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT－3′． 下 游 引 物 P6：5′－CGggatccTACGGCTACCTTGTTACGACTCACCCC－3′． 其中小写字母为 BamH I 酶切位点其上下游 序列分别对应于 E．coli 16SrRNA 基因的第8～37 个碱基位置和第1479～1506个碱基位置． 1∙5∙3 反应体系 参考《PCR 技术实验指南》中 PCR 的设计原 则综合考虑各个因子的影响水平设计采用20μL 体系：模板 DNA1μL引物各1μLdNTPs1μLTap 酶0∙3μL10x PCR buffer2μL加 dH2O 补足至20 μL． 1∙5∙4 退火温度 以引物的理论退火温度 T＝58℃为基准在附 件 设 计 梯 度 实 验 验 证选 取 最 佳 退 火 温 度 Ta＝53℃． 1∙5∙5 PCR 参数 PCR 参数：95℃预变性4min→在94℃保持 45s→在53℃保持45s→在72℃保持30s→30个循 环→最终在72℃延伸1∙5min． 1∙5∙6 回收测序和分析 PCR 产物切胶后用胶回收试剂盒（赛百盛生物 有限公司）回收回收产物进行 PCR 产物直接测序． 所得16SrDNA 序列通过 Blast 与 Genebank 数据库 进行比较． 1∙6 絮凝活性分布 取10mL 的发酵液在5000r／min 的转速下离 心分离得上清液及底部浓度较大的两部分．底部 浓度较大的部分中加生理盐水在5000r／min 的转 速下离心分离两次倒掉上清液底部沉淀物即为絮 凝剂产生菌将沉淀物中加入10mL 生理盐水制成 细胞悬浊液．分别测定发酵原液、上清液以及细胞 悬浊液的絮凝活性． 1∙7 热稳定性试验 将离心去除菌体的培养液置于高压锅中在 121℃灭菌20min之后按1∙3∙2节的方法测定其絮 凝活性． 1∙8 培养条件对菌体生长及絮凝剂产生的影响 对筛选出来的混合菌分别改变培养条件如培 养基的成分及初始 pH 值、培养温度、摇床转速等因 素测定发酵液的絮凝活性以确定混合双菌产絮凝 剂的最优条件． 1∙9 絮凝剂粗品提取 将发酵液置于冷冻离心机中10000r／min离 心10min留取上清液弃去菌体．将3倍无水冷乙 醇加入上清液中沉淀絮凝物质．取絮凝剂沉淀 4000r／min离心10min弃去上清将沉淀部分真 空干燥得絮凝剂粗品［4］． 2 结果与讨论 2∙1 絮凝菌株筛选结果 本试验初筛共分离出絮凝产生菌13株复筛后 发现其中3株 L2、L5 和 L9 具有较强转化效率其絮 凝率分别为42∙1％、56∙7％、63％． 在实验中发现细菌 L2 在牛肉膏蛋白胨培养基 上生长旺盛但只能在查氏培养液中产生絮凝剂不 过该培养液不利于其菌体生长；细菌 L5 只能在查氏 中生长并产生絮凝剂在其余三种培养基上几乎不 生长也不产絮凝剂；霉菌 L9 可在通用发酵培养液、 查氏培养液和高氏一号培养液中产生絮凝剂其中 以查氏培养液中产生的絮凝剂较好．综上所述本 试验选定查氏培养基为后续试验用培养基． 2∙2 双菌混合培养的正交试验 将3株絮凝菌株按照1∶1接种进行混合培养 发现 L2 和 L5 菌株组合所得发酵液絮凝效果优于其 他各组同时也优于各个单菌培养液及各单菌培养 Vol．29Suppl．2 林海等： 产絮凝剂双菌复合发酵体系的研究以及在水处理中的应用 ·31·
.32 北京科技大学学报 2007年增刊2 液按1：1投加的絮凝效果（表1），因此后续试验中 100 采用L2和L5作为复合型生物絮凝剂产生菌，将其 命名为LH用于生产复合型生物絮凝剂MBF-LH. 80 表1两菌混合培养絮凝率 60 混合培养时 各单菌培养液按1：1投 组别 40 絮凝率/% 加时絮凝率/% 83.7 53.2 20 L2十L5 L2十Lg 32.5 36.3 发酵液 上清液 细胞悬浮液 Ls十Lg 45.3 59.8 图1絮凝活性分布 本试验中L2和L5混合培养时具有某种协同增 效作用，现有研究认为，单株微生物的发酵存在目标 2.6培养条件对菌体生长及絮凝剂产生的影响 产物转化效率低，培养条件要求严格和对环境因素 2.6.1碳源种类的影响 适应性差等缺陷，混合培养的条件下，不同微生物之 不同的菌株对不同碳源的利用程度不同，本试 间的相互作用促进微生物絮凝剂的产生山]；而其余 验选择不同碳源代替查氏液体培养基中的相应组分 两组混合菌絮凝率非但没有提高反而降低，它们之 以考察LH分泌絮凝剂的最适生长碳源，由图2可 间应该是具有某种拮抗抑制作用 知，该复合菌以蔗糖为碳源时絮凝剂产量最高，絮凝 2.316 S rRNA测序结果 率可达75.8%；该复合菌以蔗糖为碳源时菌体生长 PCR产物经纯化后测序，所得L2和L5的 量最大，综合考虑菌体生长，絮凝剂产量及市场供 1l6 SrRNA序列，通过Blast与Genebank数据库进行 应方便及价格，本试验选择较常用的蔗糖作为碳源， 比较获得GenBank登陆号(GenBank Accession 80 1.2 一空白培养基 Number)1007875和1007867，将序列结果与 絮凝率% 10 Genebank中其他序列进行同源性分析(BLASTn), Z☑发酵液 絮凝率% OD660 0.8 结果表明L2菌的16 S rRNA序列和数据库中的 Micrococcus sp·MACLO3菌株的序列的同源性为 40 .6 号 99%,在系统发育树中L2菌株和Micrococcus sp, MACLO3菌在同一分支，因此可以判断其为Micro~ 20 coccus sp·L5菌的16 S rRNA序列和数据库中的 Paenibacillus velaei P1菌株的序列的同源性为 乙酸钠淀粉木糖糖葡萄糖谷氨酸钠 碳源种类 99%,在系统发育树中L5菌株和Paenibacillus ve laei P1菌在同一分支，因此可以判断其为Paeni- 图2碳源种类对絮凝活性的影响 bacillus velaei. 2.6.2氨源种类的影响 2.4絮凝活性分布 氮源的作用是提供微生物合成细胞含氨物质的 发酵液、离心后上清液以及细胞悬浊液的絮凝 原料，它是核酸及蛋白质的主要成分，是构成生物体 活性测定结果表明（图1），上清液的絮凝活性远高 的必需元素，本试验中培养基的碳源为蔗糖，氨源 于沉淀物，说明絮凝有效成分主要存在于发酵液中， 为变量，其余条件与碳源实验相同，实验结果见图 是微生物细胞的代谢产物，同时菌体细胞和代谢残 余物质有一定促进絮凝的作用 从图3得出，在五种氨源中对于促进絮凝剂产 2.5热稳定性试验 生来讲无机氮要优于有机氨，而对于菌体生长来说 将发酵液在121℃灭菌20min,测定其絮凝率 则相反，其中硝酸钠最有利于该复合菌产生絮凝 为76.3%，与未经过灭菌处理的发酵液相比，絮凝 剂，絮凝率达到75.1%.酵母浸粉最有利于菌体生 率仅下降了9.3%，说明混合菌所产絮凝剂具有良 长但不利于絮凝剂的产生，并且当以硝酸钠为氨源 好的热稳定性，这将有利于有效成份的提取、纯化， 时，菌体生长量也较大，因此综合考虑各种因素，最 为该絮凝剂产业化生产的安全性提供了保障， 终选择硝酸钠为最优氮源
液按1∶1投加的絮凝效果（表1）因此后续试验中 采用 L2 和 L5 作为复合型生物絮凝剂产生菌将其 命名为 LH 用于生产复合型生物絮凝剂 MBF－LH． 表1 两菌混合培养絮凝率 组别 混合培养时 絮凝率／％ 各单菌培养液按1∶1投 加时絮凝率／％ L2＋L5 83∙7 53∙2 L2＋L9 32∙5 36∙3 L5＋L9 45∙3 59∙8 本试验中 L2 和 L5 混合培养时具有某种协同增 效作用现有研究认为单株微生物的发酵存在目标 产物转化效率低培养条件要求严格和对环境因素 适应性差等缺陷混合培养的条件下不同微生物之 间的相互作用促进微生物絮凝剂的产生［11］；而其余 两组混合菌絮凝率非但没有提高反而降低它们之 间应该是具有某种拮抗抑制作用． 2∙3 16S rRNA 测序结果 PCR 产物经纯化后测序所得 L2 和 L5 的 16SrRNA 序列通过 Blast 与 Genebank 数据库进行 比较 获 得 GenBank 登 陆 号 （GenBank Accession Number）1007875 和 1007867． 将 序 列 结 果 与 Genebank 中其他序列进行同源性分析（BLAST n） 结果表明 L2 菌的16S rRNA 序列和数据库中的 Micrococcus sp．MACL03菌株的序列的同源性为 99％在系统发育树中 L2 菌株和 Micrococcus sp． MACL03菌在同一分支因此可以判断其为 Micrococcus sp．．L5 菌的16S rRNA 序列和数据库中的 Paenibacillus velaei P1 菌 株 的 序 列 的 同 源 性 为 99％在系统发育树中 L5 菌株和 Paenibacillus velaei P1菌在同一分支因此可以判断其为 Paenibacillus velaei． 2∙4 絮凝活性分布 发酵液、离心后上清液以及细胞悬浊液的絮凝 活性测定结果表明（图1）上清液的絮凝活性远高 于沉淀物说明絮凝有效成分主要存在于发酵液中 是微生物细胞的代谢产物同时菌体细胞和代谢残 余物质有一定促进絮凝的作用． 2∙5 热稳定性试验 将发酵液在121℃灭菌20min测定其絮凝率 为76∙3％与未经过灭菌处理的发酵液相比絮凝 率仅下降了9∙3％说明混合菌所产絮凝剂具有良 好的热稳定性．这将有利于有效成份的提取、纯化 为该絮凝剂产业化生产的安全性提供了保障． 图1 絮凝活性分布 2∙6 培养条件对菌体生长及絮凝剂产生的影响 2∙6∙1 碳源种类的影响 不同的菌株对不同碳源的利用程度不同本试 验选择不同碳源代替查氏液体培养基中的相应组分 以考察 LH 分泌絮凝剂的最适生长碳源．由图2可 知该复合菌以蔗糖为碳源时絮凝剂产量最高絮凝 率可达75∙8％；该复合菌以蔗糖为碳源时菌体生长 量最大．综合考虑菌体生长絮凝剂产量及市场供 应方便及价格本试验选择较常用的蔗糖作为碳源． 图2 碳源种类对絮凝活性的影响 2∙6∙2 氮源种类的影响 氮源的作用是提供微生物合成细胞含氮物质的 原料它是核酸及蛋白质的主要成分是构成生物体 的必需元素．本试验中培养基的碳源为蔗糖氮源 为变量其余条件与碳源实验相同．实验结果见图 3． 从图3得出在五种氮源中对于促进絮凝剂产 生来讲无机氮要优于有机氮而对于菌体生长来说 则相反．其中硝酸钠最有利于该复合菌产生絮凝 剂絮凝率达到75∙1％．酵母浸粉最有利于菌体生 长但不利于絮凝剂的产生并且当以硝酸钠为氮源 时菌体生长量也较大．因此综合考虑各种因素最 终选择硝酸钠为最优氮源． ·32· 北 京 科 技 大 学 学 报 2007年 增刊2
Vol.29 Suppl.2 林海等：产絮凝剂双菌复合发酵体系的研究以及在水处理中的应用 ,33 80 3.5 时，菌体生长量最小，但絮凝剂产量最大，这是因为 70 3.0 复合菌中的L5为Paenibacillus velaei菌，该细菌具 2.5 有固氨功能1]，它自身固定的氦就能满足复合菌生 长和分泌絮凝剂的需要，此外氨浓度再增大反而对 2.0 % 复合菌分泌絮凝剂有抑制作用.因此本试验最终选 1.5 择不加氨源， ☑絮凝率% 1.0 OD 90 3.5 10 0.5 0 中 3.0 硫酸铵酵母浸粉蛋白胨硝酸钠 80 2.5 氨源种类 +一絮凝率% 2.0 图3氮源种类对絮凝活性的影响 0-OD660 15 70 2.6.3碳源浓度的影响 1.0 培养基中碳的浓度对发酵产品的质量和细胞的 0.5 生长繁殖都会产生一定的影响，本试验中培养基的 0.20.5 0.7 碳源为蔗糖其用量为变量，氮源为硝酸钠，其余条件 氮的浓度gL) 与碳源实验相同，试验结果如图4所示. 图5氮的浓度对絮凝活性的影响 90 1.8 85 1.6 2.6.5不同无机盐的影响 80 1.g 无机盐的种类和浓度对微生物絮凝剂活性影响 1 1.0 很大，某些适当浓度的无机盐可以促进絮凝剂的合 0.88 成.本试验考察单一无机盐对絮凝活性的影响.基 0.6 本培养基成分：蔗糖10g/L,无机盐0.2g/L,发酵条 601 一絮凝率% 0.4 件与碳源实验相同，试验结果如图6所示 55 0.2 50246810141628 ☑絮凝率% □无菌空白絮凝率%◆OD 100 1.6 碳的浓度八gL) 14 80 1.2 图4碳源浓度对絮凝活性的影响 60 1.0 0.8 由图4可以看出，在一定范围内絮凝率随着碳 40 0.6 浓度的增大而增大，当碳浓度为4gL(相当于蔗糖 0.4 20 0.2 浓度10g/L)时，絮凝率最大，达到83.6%.此后继 0 0 续增加碳的浓度，絮凝率开始下降，当碳源浓度为 20g/L时，菌体的生长量最大，但此时，絮凝剂的絮 凝活性不高。因此选择碳源浓度为4gL· 2.6.4氮源浓度的影响 图6无机盐对絮凝活性的影响 在微生物的生长过程中，如果氨源适量，会促进 加入各种无机盐的发酵液与不加无机盐的对照 生物体的生长繁殖，若氨源过量，会抑制生物体的生 发酵液相比，除了钼酸铵和氯化钡对絮凝剂的产生 长繁殖，因此应在培养基中加入适量的氮源以满足 有抑制作用外，其他的无机盐都对絮凝剂的产生有 微生物对氨源的需要，本试验中培养基的碳源为蔗 促进作用.其中氯化钾、磷酸氢二钾、硫酸铝、硫酸 糖10g/L,氨源为硝酸钠其用量为变量，其余条件与 铁、硫酸锰、硫酸钙对产絮凝剂有很强的促进作用 碳源实验相同，试验结果如图5所示（其中1g 由图6可以看出，Alz(S04)3、FeS04、MnS04、MgS04 NaN03含有0.16g氮) 本身就具有较高的絮凝能力，因此选择不添加这几 由图5可知，絮凝活性随着氨浓度的增加而降 种无机盐。同时考虑发酵液的絮凝活性、菌体生长 低.当不加氮源时，絮凝活性最大，达到87.5%.菌 和无机盐本身的絮凝活性，最终选择添加KC、 体的生长量随着氨源浓度的增加而增加，当无氮源 CaS04、K2HP04这三种无机盐
图3 氮源种类对絮凝活性的影响 2∙6∙3 碳源浓度的影响 培养基中碳的浓度对发酵产品的质量和细胞的 生长繁殖都会产生一定的影响．本试验中培养基的 碳源为蔗糖其用量为变量氮源为硝酸钠其余条件 与碳源实验相同．试验结果如图4所示． 图4 碳源浓度对絮凝活性的影响 由图4可以看出在一定范围内絮凝率随着碳 浓度的增大而增大当碳浓度为4g／L（相当于蔗糖 浓度10g／L）时絮凝率最大达到83∙6％．此后继 续增加碳的浓度絮凝率开始下降．当碳源浓度为 20g／L 时菌体的生长量最大但此时絮凝剂的絮 凝活性不高．因此选择碳源浓度为4g／L． 2∙6∙4 氮源浓度的影响 在微生物的生长过程中如果氮源适量会促进 生物体的生长繁殖若氮源过量会抑制生物体的生 长繁殖因此应在培养基中加入适量的氮源以满足 微生物对氮源的需要．本试验中培养基的碳源为蔗 糖10g／L氮源为硝酸钠其用量为变量其余条件与 碳源实验相同．试验结果如图5所示（其中1g NaNO3 含有0∙16g 氮）． 由图5可知絮凝活性随着氮浓度的增加而降 低．当不加氮源时絮凝活性最大达到87∙5％．菌 体的生长量随着氮源浓度的增加而增加当无氮源 时菌体生长量最小但絮凝剂产量最大这是因为 复合菌中的 L5 为 Paenibacillus velaei 菌该细菌具 有固氮功能［12］它自身固定的氮就能满足复合菌生 长和分泌絮凝剂的需要此外氮浓度再增大反而对 复合菌分泌絮凝剂有抑制作用．因此本试验最终选 择不加氮源． 图5 氮的浓度对絮凝活性的影响 2∙6∙5 不同无机盐的影响 无机盐的种类和浓度对微生物絮凝剂活性影响 很大某些适当浓度的无机盐可以促进絮凝剂的合 成．本试验考察单一无机盐对絮凝活性的影响．基 本培养基成分：蔗糖10g／L无机盐0∙2g／L发酵条 件与碳源实验相同试验结果如图6所示． 图6 无机盐对絮凝活性的影响 加入各种无机盐的发酵液与不加无机盐的对照 发酵液相比除了钼酸铵和氯化钡对絮凝剂的产生 有抑制作用外其他的无机盐都对絮凝剂的产生有 促进作用．其中氯化钾、磷酸氢二钾、硫酸铝、硫酸 铁、硫酸锰、硫酸钙对产絮凝剂有很强的促进作用． 由图6可以看出Al2（SO4）3、FeSO4、MnSO4、MgSO4 本身就具有较高的絮凝能力因此选择不添加这几 种无机盐．同时考虑发酵液的絮凝活性、菌体生长 和无机盐本身的絮凝活性最终选择添加 KCl、 CaSO4、K2HPO4 这三种无机盐． Vol．29Suppl．2 林海等： 产絮凝剂双菌复合发酵体系的研究以及在水处理中的应用 ·33·
.34 北京科技大学学报 2007年增刊2 2.6.6初始pH值的影响 需氧量又会破坏絮凝物质的生成，从图9的试验结 从图7可以看出，复合菌LH受培养基初始pH 果可知，通气量在摇床转速100~140r/min范围内， 值的影响较大，不同的初始pH值，菌体发酵液对高 絮凝效果较好，有利于LH的生长，防止菌体絮凝成 岭土悬浊液的絮凝率变化幅度很大，当pH值在4~ 较大颗粒.当摇床转速在120r/min时，絮凝率最 5之间时，絮凝率很低，此时发酵液较澄清，菌体生 大，可达92.7%；当摇床转速升为160~200r/mim 成量少，絮凝率较低，可见，要得到培养液的高絮凝 时，絮凝率大大降低 率，首先要保证菌体的适量生长，当pH值为6~7 100 时，絮凝率明显上升，pH值在8时，絮凝率最高，达 90 到了92.3%.当pH再升高，絮凝活性又明显下降， 80 可见过高的培养液初始H对菌体分泌絮凝物质也 不利.因此，经过比较培养基的初始H值对絮凝活 店意话 60 50 性的影响，最适初始pH值为8. 40 95 9 120140160180200 85 摇床转速(rmin) 80 图9摇床转速对絮凝活性的影响 75 2.7BFLH和常见絮凝剂对二级出水絮凝效果 65 的比较 89 污水处理厂的二级出水为微污染水，其深度处 7 10 初始pH 理通常采用絮凝沉淀法，较常用的絮凝剂有无机絮 凝剂（聚合氯化铝PAC和聚合硫酸铁PFS)和有机 图7初始pH值对絮凝率的影响 絮凝剂（聚丙烯酰胺PAM)·本研究把常用絮凝剂 2.6.7培养温度的影响 和复合菌LH产生的絮凝剂MBF-LH在不同用量 由图8可知，对于该复合菌，最适生长温度和最 下对二级出水的絮凝效果进行比较. 适产絮凝剂的温度不一致.当温度为34℃时，菌体 试验结果如图10所示，在絮凝剂浓度小于40 的生长量最大，当温度在30℃和37℃时，菌体生长 mg/L的范围内，微生物絮凝剂MBF-LH的絮凝率 量迅速降低，该复合菌产絮凝剂的最适温度为 明显高于其他絮凝剂；当浓度超过40mgL时，微生 30℃，此时絮凝率达到92.1%；而温度在15~30℃ 物絮凝剂的絮凝效果急剧下降，PFS和PAM的絮 范围时，絮凝活性变化不大，这个温度范围也正是实 凝能力明显提高，PAC的絮凝能力也有一定提高， 际生产中的温度范围，这非常有利于该复合菌将来 可见微生物絮凝剂MBF-LH的絮凝效率最高，而 的实际应用 且达到较高絮凝率时用量较少，同时其降解产物无 95 毒无害不会造成污染，因此较其他絮凝剂具有更大 90k 的应用潜力 的 100 ·絮凝率/% OD600 ◆-MBF-LH 80 80 -0-PAC ★-PFS 75 o-PAM 60 1015 20 253034 3>0 解40 培养温度/℃ 20 图8培养温度对絮凝率的影响 0002030405060708090100i0 2.6.8通气量的影响 絮凝剂浓度(mgL-) 摇床转速的大小直接关系到发酵体系需氧量的 高低，过低的需氧量不利于菌体快速生长，而过高的 图10不同絮凝剂絮凝效果的比较
2∙6∙6 初始 pH 值的影响 从图7可以看出复合菌 LH 受培养基初始 pH 值的影响较大不同的初始 pH 值菌体发酵液对高 岭土悬浊液的絮凝率变化幅度很大．当 pH 值在4～ 5之间时絮凝率很低此时发酵液较澄清菌体生 成量少絮凝率较低可见要得到培养液的高絮凝 率首先要保证菌体的适量生长．当 pH 值为6～7 时絮凝率明显上升pH 值在8时絮凝率最高达 到了92∙3％．当 pH 再升高絮凝活性又明显下降 可见过高的培养液初始 pH 对菌体分泌絮凝物质也 不利．因此经过比较培养基的初始 pH 值对絮凝活 性的影响最适初始 pH 值为8． 图7 初始 pH 值对絮凝率的影响 2∙6∙7 培养温度的影响 由图8可知对于该复合菌最适生长温度和最 适产絮凝剂的温度不一致．当温度为34℃时菌体 的生长量最大当温度在30℃和37℃时菌体生长 量迅速降低．该复合菌产絮凝剂的最适温度为 30℃此时絮凝率达到92∙1％；而温度在15～30℃ 范围时絮凝活性变化不大这个温度范围也正是实 际生产中的温度范围这非常有利于该复合菌将来 的实际应用． 图8 培养温度对絮凝率的影响 2∙6∙8 通气量的影响 摇床转速的大小直接关系到发酵体系需氧量的 高低过低的需氧量不利于菌体快速生长而过高的 需氧量又会破坏絮凝物质的生成．从图9的试验结 果可知通气量在摇床转速100～140r／min 范围内 絮凝效果较好有利于 LH 的生长防止菌体絮凝成 较大颗粒．当摇床转速在120r／min 时絮凝率最 大可达92∙7％；当摇床转速升为160～200r／min 时絮凝率大大降低． 图9 摇床转速对絮凝活性的影响 2∙7 MBF－LH 和常见絮凝剂对二级出水絮凝效果 的比较 污水处理厂的二级出水为微污染水其深度处 理通常采用絮凝沉淀法较常用的絮凝剂有无机絮 凝剂（聚合氯化铝 PAC 和聚合硫酸铁 PFS）和有机 絮凝剂（聚丙烯酰胺 PAM）．本研究把常用絮凝剂 和复合菌 LH 产生的絮凝剂 MBF－LH 在不同用量 下对二级出水的絮凝效果进行比较． 试验结果如图10所示在絮凝剂浓度小于40 mg／L 的范围内微生物絮凝剂 MBF－LH 的絮凝率 明显高于其他絮凝剂；当浓度超过40mg／L 时微生 物絮凝剂的絮凝效果急剧下降PFS 和 PAM 的絮 凝能力明显提高PAC 的絮凝能力也有一定提高． 可见微生物絮凝剂 MBF－LH 的絮凝效率最高而 且达到较高絮凝率时用量较少同时其降解产物无 毒无害不会造成污染因此较其他絮凝剂具有更大 的应用潜力． 图10 不同絮凝剂絮凝效果的比较 ·34· 北 京 科 技 大 学 学 报 2007年 增刊2
Vol.29 Suppl.2 林海等：产絮凝剂双菌复合发酵体系的研究以及在水处理中的应用 .35. [2]Yokoi H.Yoshida T,Mori S,Hirose J.HayashiS.Takasaki Y. 3结论 Biopolymer flocculant produced by an Enterobacter sp.Biotechnol Lett,1996,19:569 (1)筛选到三株MBF产生菌，将其进行双菌混 [3]Suh H.Know G.Lee C.Kim H.Oh H,Yoon B.Characteriza- 合培养的正交试验构建出了比单一菌所产MBF絮 tion of bioflocculant produced by Bacillus sp.DP-152.J Fer- 凝活性更高的复合菌群LH,它们相互之间的协同 ment Bioeng.1997.84:108 作用使其所产絮凝剂MBF-LH的絮凝活性大大提 [4]Salehizadeh H.Vossoughi M,Alemzadeh I.Some investigations 高，表明构建复合菌群是MBF研究与开发的一个 on bioflocculant producing bacteria.Biochem Eng J.2000.5:39 重要方向 [5]马放，刘俊良复合型微生物絮凝剂的开发.中国给水排水， 2003,19(4):124 (②)通过对其性质的研究发现，该混合菌所产 [6]钱存柔，黄仪秀.微生物学实验教程.北京：北京大学出版社， 絮凝剂为胞外代谢产物，其热稳定性非常好 2003.205-206 (3)通过培养条件优化试验使得LH对高岭土 [7]魏晓金，王光辉，雷国元·生物絮凝剂产生菌筛选及培养条件的 的絮凝效率从75.8%提高到92.7%，并得到较适宜 研究.武汉科技大学学报（自然科学版），2006,29(1)：70 的培养条件：蔗糖10g/L,KCl0.2g/L,Cas040.2 [8]罗平，罗固源，邹小兵，等.一株产生物絮凝剂的Bacillus即· 的分离与鉴定.城市环境与城市生态，2005,18(2)：21 g/L,KzHP040.2g/L,pH8,30℃，120r/min恒温振 [9]朱艳彬，杨基先，马放，等.复合型生物絮凝剂产生菌筛选及絮 荡培养 凝机理研究.哈尔滨工业大学学报，2004,36(6)：760 (4)与目前常见絮凝剂相比，絮凝剂MBF-LH [10]何琳燕，殷永娴，黄为一.一株硅酸盐细菌的鉴定及其系统发 具有用量少、絮凝效率高的特点 育学分析.微生物学报，2003,43(2)：162 [11]Kurane R.Matsuyama H.Production of a boofloccur lant by 参考文献 mixed culture.Biosci Biotechnol Biochem.1994.58:1589 [1]Cumming R H.Robinson P M,Martin C F.Flocculation of E. [12]丁延芹，王建平，刘元，等.几株固氮芽孢杆菌的分离与鉴定 Coli with cationic polymers.Bioseparation.1996,6:17 农业生物技术学报，2004,12(6)：690 Investigations on producing bioflocculant by double microorganisms and its applica- tion on water treatment LIN Hai,HAO Jie,HOU Ruirong,ZHANG Shiyong School of Civil and Environmental Engineering,University of Science and Technology Beijing.Beijing 100083.China ABSTRACI Three strains of bacteria which produce flocculating substances were isolated from activated sludge and soil.Every two strains of the bacteria among the 3 strains obtained above were selected to mix ferment by orthogonal experiment.The results showed that the combination of two strains called LH possessed the best flocculating activity.Identified on the base of 16SrRNA gene sequence,the two strains were pertained to Mi- crococcus sp.and Paenibacillus velaei.Though the preliminary study of the MBF-LH,it had been confirmed that MBF-LH is a kind of extracellular biopolymer and has a good thermostabilization.The best carbon source, optimal cultural temperature,initial pH value and rate of rotary shaker were saccharose,30C,pH 8 and 120r/ min.Addition of KCl,CaSO4 and K2HPO4 to the culture medium could obviously increase the flocculating rate. When applied to the wastew ater treatment,MBF-LH had some good properties such as low dosage and high ef- ficiency· KEY WORDS microbial flocculants:multiple microorganisms:16SrRNA;culture condition optimizing
3 结论 （1） 筛选到三株 MBF 产生菌将其进行双菌混 合培养的正交试验构建出了比单一菌所产 MBF 絮 凝活性更高的复合菌群 LH它们相互之间的协同 作用使其所产絮凝剂 MBF－LH 的絮凝活性大大提 高表明构建复合菌群是 MBF 研究与开发的一个 重要方向． （2） 通过对其性质的研究发现该混合菌所产 絮凝剂为胞外代谢产物其热稳定性非常好． （3） 通过培养条件优化试验使得 LH 对高岭土 的絮凝效率从75∙8％提高到92∙7％并得到较适宜 的培养条件：蔗糖10g／LKCl 0∙2g／LCaSO40∙2 g／LK2HPO40∙2g／LpH830℃120r／min 恒温振 荡培养． （4） 与目前常见絮凝剂相比絮凝剂 MBF－LH 具有用量少、絮凝效率高的特点． 参 考 文 献 ［1］ Cumming R HRobinson P MMartin G F．Flocculation of E． Coli with cationic polymers．Bioseparation19966：17 ［2］ Yokoi HYoshida TMori SHirose JHayashi STakasaki Y． Biopolymer flocculant produced by an Enterobacter sp．Biotechnol Lett199619：569 ［3］ Suh HKnow GLee CKim HOh HYoon B．Characterization of bioflocculant produced by Bacillus sp．DP－152．J Ferment Bioeng199784：108 ［4］ Salehizadeh HVossoughi MAlemzadeh I．Some investigations on bioflocculant producing bacteria．Biochem Eng J20005：39 ［5］ 马放刘俊良．复合型微生物絮凝剂的开发．中国给水排水 200319（4） ：124 ［6］ 钱存柔黄仪秀．微生物学实验教程．北京：北京大学出版社 2003．205～206 ［7］ 魏晓金王光辉雷国元．生物絮凝剂产生菌筛选及培养条件的 研究．武汉科技大学学报（自然科学版）200629（1）：70 ［8］ 罗平罗固源邹小兵等．一株产生物絮凝剂的 Bacillus sp． 的分离与鉴定．城市环境与城市生态200518（2）：21 ［9］ 朱艳彬杨基先马放等．复合型生物絮凝剂产生菌筛选及絮 凝机理研究．哈尔滨工业大学学报200436（6）：760 ［10］ 何琳燕殷永娴黄为一．一株硅酸盐细菌的鉴定及其系统发 育学分析．微生物学报200343（2）：162 ［11］ Kurane RMatsuyama H．Production of a boofloccur lant by mixed culture．Biosci Biotechnol Biochem199458：1589 ［12］ 丁延芹王建平刘元等．几株固氮芽孢杆菌的分离与鉴定． 农业生物技术学报200412（6）：690 Investigations on producing bioflocculant by double microorganisms and its application on water treatment LIN HaiHAO JieHOU RuirongZHA NG Shiyong School of Civil and Environmental EngineeringUniversity of Science and Technology BeijingBeijing100083China ABSTRACT Three strains of bacteria which produce flocculating substances were isolated from activated sludge and soil．Every two strains of the bacteria among the3strains obtained above were selected to mix ferment by orthogonal experiment．The results showed that the combination of two strains called LH possessed the best flocculating activity．Identified on the base of 16SrRNA gene sequencethe two strains were pertained to Micrococcus sp．and Paenibacillus velaei．Though the preliminary study of the MBF－LHit had been confirmed that MBF－LH is a kind of extracellular biopolymer and has a good thermostabilization．The best carbon source optimal cultural temperatureinitial pH value and rate of rotary shaker were saccharose30℃pH8and120r／ min．Addition of KClCaSO4and K2HPO4to the culture medium could obviously increase the flocculating rate． When applied to the wastewater treatmentMBF－LH had some good properties such as low dosage and high efficiency． KEY WORDS microbial flocculants；multiple microorganisms；16SrRNA；culture condition optimizing Vol．29Suppl．2 林海等： 产絮凝剂双菌复合发酵体系的研究以及在水处理中的应用 ·35·